重组酵母生产的疼痛受体调制器nonivamide香兰素gydF4y2Ba

1介绍gydF4y2Ba

辣椒素是植物生物碱具有较强的TRPV1受体激动剂活动(瞬时受体电位阳离子通道亚V成员1)。他们在食品行业有几个应用程序,如色素、调味料和风味增强,在制药行业,尤其是对他们的抗炎、镇痛属性(gydF4y2BaBaenas et al ., 2019gydF4y2Ba;gydF4y2BaKoivisto et al ., 2021gydF4y2Ba)。在辣椒生产前和收获后的不利影响因素,如环境、遗传型的储存条件,影响的数量和成分辣椒碱(gydF4y2BaUarrota et al ., 2021gydF4y2Ba)。的发展与代谢工程酵母发酵过程可能会使更有效的生产工厂(相比gydF4y2BaMuratovska et al ., 2022 bgydF4y2Ba)。面包酵母,gydF4y2Ba酿酒酵母gydF4y2Ba,是一家著名的生产主机在工业微生物学和最近研发了几种方法的使用biosynthesize自然产品,如萜类化合物(大麻类)、类黄酮和betalains (gydF4y2BaRomero-Suarez et al ., 2022gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

植物,主要生物合成涉及到phenylpropanoid通往vanillylamine(来自香兰素)和脂肪酸合成途径CoA-activated脂肪酸,amide-forming凝聚的gydF4y2BaNgydF4y2Ba酰基转移酶(辣椒素合成酶)(gydF4y2Ba小川et al ., 2015gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba新创gydF4y2Ba在酵母生物合成辣椒素迄今为止没有发达国家和需要的功能表达外源基因和几个路由的内源性生化途径。以前,酵母工程生产香兰素和香草糖糖苷gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba莽草酸途径(gydF4y2Ba汉森et al ., 2009gydF4y2Ba;gydF4y2BaStrucko et al ., 2015gydF4y2Ba)。也有例子的工程酵母生产的碳链脂肪酸(gydF4y2BaGajewski et al ., 2017gydF4y2Ba;gydF4y2Ba朱et al ., 2020gydF4y2Ba)。酵母表达gydF4y2BaNgydF4y2Ba酰基转移酶和CoA-ligasegydF4y2Ba甜椒gydF4y2Ba(CaAT) (gydF4y2Ba康et al ., 2005gydF4y2Ba),gydF4y2BaSphingomonasgydF4y2Basp。Ibu-2 (IpfF) (gydF4y2Ba2013年默多克和干草gydF4y2Ba分别),最近被证明使生产nonivamide(主要)模型从补充vanillylamine non-anoic酸(gydF4y2BaMuratovska et al ., 2022 agydF4y2Ba),如主要合成的最后一步。gydF4y2Ba

通路的关键一步是vanillylamine香草醛的还原胺化作用形式,以前没有显示在酵母。反应是受一个不利的热力学平衡,在于使用内生时醛胺捐助者的方向(如gydF4y2BalgydF4y2Ba丙氨酸);然而,这可能是受一些策略。香兰素aminotransaminase从gydF4y2Ba辣椒spgydF4y2Ba。(gydF4y2Ba韦伯et al ., 2014 bgydF4y2Ba),以及gydF4y2Ba色素细菌violaceumgydF4y2Ba胺转氨酶(CvTA),已被证明是功能在酵母。然而,这些只有应用全细胞生产动力解决外消旋手性胺的胺酮(胺),自反方向(酮胺)已被证明是非常难实现的gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba(gydF4y2Ba韦伯et al ., 2014 agydF4y2Ba;gydF4y2Ba韦伯et al ., 2014 bgydF4y2Ba;gydF4y2Ba克努森et al ., 2016gydF4y2Ba;gydF4y2Ba韦伯et al ., 2017gydF4y2Ba)。这是最近虽然vanillylamine生产的工程实现gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba(gydF4y2Ba傅et al ., 2021gydF4y2Ba),gydF4y2Ba假单胞菌putidagydF4y2Ba(gydF4y2BaManfrao-Netto et al ., 2021gydF4y2Ba),表达CvTA和丙氨酸脱氢酶gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2Ba(BsAlaDH) (gydF4y2BaKoszelewski et al ., 2008gydF4y2Ba)。成功的关键是co-expression CvTA和BsAlaDH结合有利于胺形成合适的反应条件。转氨酶的反应与内生酒精脱氢酶活性和还原酶导致转换香兰素的副产品香草酸,和香子兰的酒精(gydF4y2Ba王et al ., 2018gydF4y2Ba)。因此,抑制策略的形成这些是必要的。在酵母乙醇脱氢酶的删除6 (ADH6)是为了减少(但不是完全移除)形成的香荚兰酒精制作vanillin-glucoside菌株改造(gydF4y2Ba汉森et al ., 2009gydF4y2Ba)。另一个策略抑制NADPH-dependent香兰素的活动还原酶和不影响还原胺化作用,通常依赖于再生NADH的可能是选择性地降低NADPH再生。这种策略曾被应用于酵母选择性支持NADH-dependent还原酶在竞争NADPH-dependent酶,从而提高立体选择性的全细胞bioreduction酮手性醇(gydF4y2BaKratzer et al ., 2008gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

这里,共同表达CvTA的酵母菌株,BsAlaDH, CaAT和IpF,删除ADH6构建和评估了还原胺和酰胺化香兰素(gydF4y2Ba图1gydF4y2Ba)。使用葡萄糖和乙醇co-substrate有氧和无氧条件下进行比较来确定环境条件有利于形成vanillylamine在酒精和酸的副产品。使用基因的组合和过程工程我们将演示使用酵母生产的nonivamide补充香兰素和non-anoic酸生物反应器控制。gydF4y2Ba

2材料和方法gydF4y2Ba

2.1菌株和媒体gydF4y2Ba

酿酒酵母gydF4y2Ba压力保持在酵母蛋白胨葡萄糖(YPD)介质(20 g LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}胨,10 g LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}酵母提取物,20 g LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}葡萄糖;20 g LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}琼脂板)。Geneticin(200毫克LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}L)和nourseothricin(100毫克gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})补充在媒体选择所需Cas9 (KanMX)和gRNA (natMX)质粒,分别。在electro-competent Sub-cloning完成gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaDH5α。溶原性肉汤(磅)介质(10 g LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}胰蛋白胨,5 g LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}酵母提取物,10 g LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}生理盐水;15 g LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}琼脂板)和100毫克LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}氨苄青霉素用于gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba液体培养和选择固体盘子。所有菌株都存储在25% (v / v)甘油−80°C。定义矿物介质(gydF4y2BaVerduyn et al ., 1992gydF4y2Ba)是用作基础生物转化,缓冲在pH值为6.5。gydF4y2Ba

2.2质粒和菌株结构gydF4y2Ba

菌株和质粒用于这项工作中列出gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba。使用标准的分子生物学方法(gydF4y2BaSambrook和罗素,2001gydF4y2Ba)。制备和诊断PCR基因工程进行使用Physion和DreamTaq聚合酶(热科学,美国),分别。所有的修改都验证了菌落PCR引物中列出gydF4y2Ba补充表S1gydF4y2Ba。使用SnapGene引物设计gydF4y2Ba^®gydF4y2Ba(GSL生物技术有限责任公司。3.03版本,我们)和购买从欧陆坊(欧陆坊基因组学、德国)。琼脂糖凝胶电泳(0.8%)是用于估计DNA片段的大小。所有的质粒(gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba)使用GeneJet纯化质粒MiniPrep工具包(热科学,美国)在传播gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba。936557年丙氨酸脱氢酶基因(基因库ID)gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2Ba(gydF4y2BaBsAlaDHgydF4y2Ba密码子优化的表达式gydF4y2Ba酿酒酵母gydF4y2Ba和获得pUC57向量(Genescript,美国)。gydF4y2BaBsAlaDHgydF4y2Ba基因扩增与限制性位点引物在SfaAI / XhoI随后克隆之间pRP005 TEF1p发起人和ADH1t终结者在同源染色体整合区域,生成pNM011。pNM012是由克隆TEF1p到质粒pCfB3034支柱。正确的构建的质粒DNA序列被Sanger测序验证(欧陆坊基因组学、德国)。gydF4y2Ba酿酒酵母gydF4y2Ba菌株被前所述工程CRISPR-Cas9工具包(gydF4y2BaJessop-Fabre et al ., 2016gydF4y2Ba)。锂acetate-based协议(gydF4y2BaGietz Schiestl, 2007gydF4y2Ba)通过添加DMSO对提高细胞渗透性,用于生成主管酵母细胞。TMB4375应变携带六份gydF4y2Ba色素细菌violaceumgydF4y2Ba胺氨基转移酶基因(gydF4y2BaCvTAgydF4y2Ba)(gydF4y2Ba韦伯et al ., 2017gydF4y2Ba)与pCfB2312转化质粒携带gydF4y2Ba酿脓链球菌gydF4y2Ba基因、SpCas9和用作背景应变应变工程。与线性化变换pNM011(使用NotI限制性内切酶)和pCfB3045 TMBNM032 (gRNA)质粒产生压力。删除gydF4y2BaADH6gydF4y2Ba是通过改变TMBNM032 PCR产品携带gydF4y2Ba本身gydF4y2Ba基因盒aureobasidin(光环)阻力和∼50个基点同源侧翼目标轨迹,TMBNM033产生压力。转化株耐光环在固体培养基和正确选择基因敲除与诊断PCR分析。密码子优化基因编码CaAT(酪胺gydF4y2BaNgydF4y2Ba——(hydroxycinnamoyl)转移酶gydF4y2Ba因此,辣椒gydF4y2Ba和IpfF(布洛芬- CoA连接酶gydF4y2BaSphingomonasgydF4y2Basp。Ibu-2))集成方法开发之前(gydF4y2BaMuratovska et al ., 2022 agydF4y2Ba),产生应变TMBNM034 (gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

2.3全细胞生物转化在摇动烧瓶和血清瓶gydF4y2Ba

在5毫升Pre-cultures准备从一个殖民地YPD一夜之间长大。摇瓶25毫升定义矿物介质(gydF4y2BaVerduyn et al ., 1992gydF4y2Ba)和葡萄糖(20 g LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}初始光密度(OD)接种gydF4y2Ba_{620海里gydF4y2Ba})0.5∼30°C在180 rpm震动孵化器孵化为26 h产生生物量。随后,酵母细胞在3220年被离心收获gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟(埃普多夫离心机5810 R,德国)和re-suspended ODgydF4y2Ba_{620海里gydF4y2Ba}∼5在50毫升的反应介质。反应介质是基于定义的矿物中缓冲pH值为6.5,并配以香兰素(5毫米)、葡萄糖(10 g LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}0.5)或乙醇(或10 g LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})作为co-substrate,有或没有gydF4y2BalgydF4y2Ba丙氨酸(50毫米)和氯化铵作为氮源(200毫米)。全细胞生物转化在有氧或无氧条件下进行。在有氧条件下,生物转化进行了500毫升含50毫升摇动烧瓶中、孵化30°C在180 rpm震动孵化器如上所述。厌氧生物转化进行密封包含50毫升瓶血清培养基和喷雾与氮气反应开始前的1 h和孵化30°C 180 rpm颤抖的孵化器。gydF4y2Ba

2.4批生物反应器查看gydF4y2Ba

Pre-cultures准备从单个菌落接种在摇瓶和50毫升定义矿物中孵化下摇晃(180 rpm) 30°C左右24 h。pre-culture用于接种3 L桌上型生物反应器(Minifors 2。在OD有限公司HT、Bottmingen、瑞士)gydF4y2Ba_{620海里gydF4y2Ba}= 0.1 1 L定义矿物中50 g LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}葡萄糖。pH值被自动保持在6.5的3 M KOH,搅拌是恒定在300 rpm,温度设定在30°C。酵母细胞最初生长在有氧条件下与空气喷射将500毫升/分钟(0.5 vvm)大约20 h,和全细胞生物转化随后开始通过增加底物(香兰素和non-anoic酸)媒体。non-sparged条件,曝气是停下来实现氧限制条件在最初的增长阶段,并直接补充前基板。gydF4y2Ba

2.5分析方法gydF4y2Ba

样本收集定期与一个注射器从细胞培养酵母细胞浓度的分析,酵母细胞生存能力,和胞外代谢物的分析。酵母细胞浓度估计通过测量光密度在620 nm (ODgydF4y2Ba_{620海里gydF4y2Ba})用分光光度计(Ultrospec 2100 pro紫外/可见分光光度计,Amersham生物科学,白金汉郡,英国)。酵母细胞生存能力被流式细胞术检测(Accuri C +、BD、美国)使用绿色我和碘化propidium SYBR荧光染料,如前所述(gydF4y2BaRao et al ., 2021gydF4y2Ba)。仪器设置调整如下:中等流量、FSC-H阈值为80000,和10000年收购事件。FCM和FlowJo数据分析gydF4y2Ba^®gydF4y2Ba(美国)。酵母细胞的控制是基于FSC-H和SSC-H信号区分细胞的背景噪音,和控制受损,完整的细胞是基于SYBR绿色我发现FL1-H (530/30 nm),和π发现FL3-H(≥670海里)信号。酵母细胞用70%乙醇治疗30分钟被用作控制识别受损细胞和调节门。分析葡萄糖、乙醇、甘油和乙酸,水高效液相色谱系统配备一个Aminex hpx - 87 H离子交换柱(7.8×300毫米,Bio-Rad,赫拉克勒斯,美国),和示差折光检测器(米尔福德港海域2414年,美国)被使用,如前所述(gydF4y2Ba韦伯et al ., 2014 bgydF4y2Ba)。流动相是5毫米HgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba所以gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba0.6毫升/分钟的流量,列是保持在60°C。香兰素的反相高效液相色谱分析,vanillylamine,香荚兰酒精和香草酸,选择C18柱(4.6×150毫米)与流动相组成的超纯水和0.1%三氟乙酸(组织)(a)和乙腈(B)。该方法权力平等主义的65%和35% B 10分钟的流1毫升分钟gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba},在室温和监控波长为281纳米,如前面描述的(gydF4y2BaManfrao-Netto et al ., 2021gydF4y2Ba)。nonivamide高效液相色谱分析之前,产品执行提取20毫升样品的生物反应器。上层清液离心后收集在3220年gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟,转移到一个开采漏斗和一个体积的乙酸乙酯提取。有机相的收集和使用旋转真空蒸发器蒸发。由此产生的粘性油溶解在1毫升的甲醇和高效液相色谱分析进行了使用相同的选择C18柱(4.6×150毫米)如前所述(gydF4y2BaMuratovska et al ., 2022 agydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

2.6计算gydF4y2Ba

的gydF4y2Ba率比gydF4y2Ba被定义为vanillylamine形成率(更易与hgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba)除以副产品(香荚兰酒精和香草酸)形成率(更易与hgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba最初的6小时)。gydF4y2Ba摩尔收率gydF4y2Ba被定义为摩尔的产品(vanillylamine)或副产品(每摩尔的香荚兰酒精或香草酸)消耗衬底(香兰素)后48 h。具体gydF4y2Bavanillylamine生产力gydF4y2Ba(µmol ODgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}hgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})计算出初始6 h。gydF4y2Ba

3结果与讨论gydF4y2Ba

3.1的比较与酵母过度表达CvTA还原胺化反应条件gydF4y2Ba

酵母携带六份CvTA基因表达本构TDH3强启动子的控制下被评估在不同反应条件下的全细胞转换香兰素vanillylamine (gydF4y2Ba补充图S1gydF4y2Ba)。大多数香草醛还原酶NADPH-dependent,香兰素脱氢酶是NAD +端依赖;因此,氧化还原平衡显著影响形成副产品。瑰柏翠积极酵母等gydF4y2Ba酿酒酵母gydF4y2Ba,葡萄糖容易发酵乙醇在有氧和无氧条件下,乙醇是慢慢地气息奄奄的在有氧条件和保持几乎惰性在厌氧条件(gydF4y2BaDe Deken 1966gydF4y2Ba)。NADPH的可用性是有限的使用乙醇作为co-substrate,尤其是在厌氧条件下导致的镇压活动NADPH-dependent还原酶(但不是NADH-dependent还原酶)(gydF4y2BaKratzer et al ., 2008gydF4y2Ba)。相比之下,NADPH在磷酸戊糖途径有效地再生在葡萄糖同化(gydF4y2BaParachin et al ., 2009gydF4y2Ba)。另一个重要因素是大量的丙酮酸形成的中心碳代谢产物和胺捐献者gydF4y2BalgydF4y2Ba酵母丙氨酸(gydF4y2Ba韦伯et al ., 2014 bgydF4y2Ba;gydF4y2Ba韦伯et al ., 2017gydF4y2Ba)。丙酮酸是一种强有力的抑制剂CvTA及其去除平衡转移到胺(gydF4y2BaSanchez-Moreno et al ., 2012gydF4y2Ba;gydF4y2Ba韦伯et al ., 2017gydF4y2Ba)。在这里,四个条件进行评估:(i)有氧以葡萄糖为碳源,(ii)有氧与乙醇作为碳源,(3)厌氧和葡萄糖作为碳源,和(iv)厌氧乙醇作为碳源。Pre-cultures被以同样的方式和全细胞生物转化在相对较高的细胞密度(ODgydF4y2Ba_{620海里gydF4y2Ba}= 5);因此,内源基因的表达水平是相同的在开始的反应,和任何产品光谱的差异是由于特定应用环境的反应。显著差异观察不同条件下,香兰素消费比率最高(0.11±0.00更易与ODgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}hgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})在有氧条件下,用乙醇作为co-substrate (gydF4y2Ba补充图S1gydF4y2Ba)。这种情况导致了更多生产vanillylamine(3.21±0.56毫米)与其他相比,但也的副产品香荚兰酒(4.11±1.48毫米)和香草酸(1.72±0.40毫米)(gydF4y2Ba补充图S1gydF4y2Ba)。比较CvTA的活动和内源酶作用于香兰素,率率,定义为vanillylamine形成每副产物生成速率,计算(gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba)。更高的速度比(5 - 7倍)观察与乙醇co-substrate,在有氧和无氧条件下。率的差异比在有氧条件下的形成主要是由于增加vanillylamine co-substrate使用乙醇。大量的香子兰的酒精和香草酸形成葡萄糖和乙醇作为co-substrate在有氧条件下,这是预期由于均衡水平的NAD (P) H / NAD (P) +比率在呼吸(gydF4y2Ba穆雷et al ., 2011gydF4y2Ba)。在厌氧条件下,转氨作用是低效率的,然而,酒精和酸形成也显著降低。值得注意的是几乎完全抑制香草酸形成在厌氧条件下,可能是由于低NAD的可用性gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba或辅酶iigydF4y2Ba^+gydF4y2Ba(gydF4y2Ba补充图就是S1C, DgydF4y2Ba)。在有氧条件下,香兰素消费率一般快,无论co-substrate的选择;然而,最终产品是由香兰素取决于co-substrate和氧的可用性的选择。gydF4y2Ba

摩尔收率最高的vanillylamine达成了在厌氧条件下与乙醇co-substrate(0.71±0.44摩尔/摩尔),而摩尔收益率最低的vanillylamine每48小时后食用香兰素葡萄糖在有氧条件下(0.15±0.05摩尔/摩尔)(gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba)。然而,一个问题在厌氧条件下是不完整的转换的香兰素。原因可能是抑制丙酮酸氨基转移酶的积累,或低限制在胺捐赠者的可用性。丙氨酸在过剩供应,被两个CvTA转化为丙酮酸,以及内源性转氨酶,例如丙氨酸转氨酶(由ALT1编码)(gydF4y2BaGarcia-Campusano et al ., 2009gydF4y2Ba)。丙酮酸可以通过转换从反应体系中移除乙醇丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶。在呼吸中,丙酮酸是由丙酮酸脱氢酶转化为乙酰辅酶a,进一步氧化三羧酸(TCA)周期有限公司gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba并生成NADH (gydF4y2BaFlikweert et al ., 1996gydF4y2Ba)。在生物转化葡萄糖存在时,会有较高的细胞内丙酮酸水平(gydF4y2Ba韦伯et al ., 2014 bgydF4y2Ba;gydF4y2Ba韦伯et al ., 2017gydF4y2Ba),这可以解释为什么条件与乙醇给更好的转氨作用收益率。gydF4y2Ba

3.2 Co-expression BsAlaDH CvTA改善vanillylamine生产gydF4y2Ba

来缓解潜在的丙酮酸抑制和提高胺捐赠者供应,一个NADH-dependant丙氨酸脱氢酶gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌,gydF4y2BaBsAlaDH,表达菌株TMBNM032 TEF1启动子的控制。Co-expression CvTA和BsAlaDH导致几乎完全转换的香兰素在48 h (gydF4y2Ba补充图S2gydF4y2Ba),这可能表明,丙酮酸积累和/或丙氨酸TMB4375限制这个问题在父母压力。香兰素消费率的应变以及vanillylamine滴定度48 h后几乎是双应变TMB4375相比,在厌氧条件下(gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba;gydF4y2Ba补充数据就是S1C, DgydF4y2Bavs。gydF4y2BaS2A补充数据,BgydF4y2Ba)。率比率(每副产品形成vanillylamine形成)TMB4375(相比没有明显不同gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba),除了在厌氧条件下与乙醇co-substrate(4.86速度比)在这里,只有少量的香子兰的酒精检测后48 h(0.9毫米;gydF4y2Ba补充图开通gydF4y2Ba)。TMB4375相比,在相同的条件下,香荚兰酒精的形成与AlaDH的表达降低了三分之一左右,和vanillylamine收益率从0.71增加到0.83摩尔/摩尔(gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

3.2.1删除ADH6减少香荚兰醇的形成gydF4y2Ba

Adh6是乙醇脱氢酶与活动NADH和NADPH,显示之前主要负责减少香兰素在酵母(gydF4y2Ba汉森et al ., 2009gydF4y2Ba;gydF4y2Ba王et al ., 2016gydF4y2Ba)。为了进一步降低香子兰的酒精,删除ADH6 TMBNM033是压力。在我们的手中,与之前的研究结果相一致,ADH6删除应变产生更少的香荚兰醇与葡萄糖(三倍少)或乙醇co-substrate比控制应变(4倍少)(gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba;gydF4y2Ba图2 a, BgydF4y2Ba)。每消耗vanillylamine香兰素的收益率更高的在所有情况下,摩尔收率最高(0.94±0.25)在厌氧条件下用乙醇作为co-substrate。观察最大的差异率比在厌氧条件下与乙醇co-substrate(12.3比4.9)。然而,在这些条件下的氨基化香兰素逮捕了大约20 h,导致不完整的转换。这表明NADH再生是限制在这些条件下,这一方面可能减少NADH-dependent香兰素的内源性还原酶减少,另一方面也减少所需的丙酮酸转化BsAlaDH丙氨酸。gydF4y2Ba

3.2.2省略丙氨酸在反应中汤改善vanillylamine生产gydF4y2Ba

丙氨酸通常添加超过在biocatalytic转氨作用而可能产生gydF4y2Ba新创gydF4y2Ba。在重组gydF4y2Bap . putidagydF4y2Ba表达CvTA BsAlaDH,丙氨酸的疏忽导致改善香草醛的还原胺化,可能由于减少数量的细胞内丙酮酸来自内生丙氨酸氨基转移酶的活性(gydF4y2BaManfrao-Netto et al ., 2021gydF4y2Ba)。是否同样适用于重组酵母表达相同的CvTA和BsAlaDH,全细胞生物转化进行使用和不与应变TMBNM033丙氨酸(gydF4y2Ba图2 c, DgydF4y2Ba)。执行的反应是在厌氧条件下用乙醇co-substrate因为这些条件被发现抑制香荚兰酒精和香草酸的形成。丙氨酸的疏忽确实有显著的积极影响vanillylamine的滴定度和产量(gydF4y2Ba图2 c, DgydF4y2Ba),在协议的结果gydF4y2Bap . putidagydF4y2Ba(gydF4y2BaManfrao-Netto et al ., 2021gydF4y2Ba)。事实上,在这些条件下的最高vanillylamine滴定度(3.65毫米)和产量从使用香兰素(0.96摩尔/摩尔)得到(gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba)。这进一步证明了丙氨酸脱氢酶有效地转化为丙酮酸丙氨酸和驱动转氨作用反应没有外部补充胺捐献者。gydF4y2Ba

3.2.3同化的乙醇co-substrate与氨基化反应gydF4y2Ba

如前所述,氨基化的香兰素在酒精与乙醇形成最青睐补充co-substrate和在生物转化在厌氧条件下,虽然反应完全中途被逮捕。gydF4y2Ba酿酒酵母gydF4y2Ba一般不能代谢乙醇厌氧,因为它需要柠檬酸和乙醛酸循环电子传递链。然而,一些乙醇可以转化为醋酸gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba乙醛的乙醇脱氢酶EC 1.1.1.1(例Adh1)和乙醛脱氢酶EC 1.2.1.3 (ex Ald6) (gydF4y2Ba拉米登et al ., 1997gydF4y2Ba;gydF4y2Bade Smidt et al ., 2008gydF4y2Ba)。这条路线使再生的NADH AlaDH ca 20 h,之后形成的vanillylamine停止(gydF4y2Ba图2 cgydF4y2Ba)。更好的看到哪些学位乙醇反应的进展,为0.5 g LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}乙醇而不是10 g LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}被使用,从而使检测甚至分钟减少通过高效液相色谱分析(gydF4y2Ba图2 dgydF4y2Ba)。前25下的乙醇滴定度确实减少了从0.40到0.27 g h LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba},或用32%,然后保持不变。乙醇消费因此vanillylamine恰逢香兰素的转换,证明它的重要性作为供应减少co-substrate等价物还原反应。香荚兰酒却不被探测到在这种情况下,vanillylamine产量高(0.92摩尔/摩尔),演示的转氨作用占主导地位的活动(gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba)。在乙醇被捕同化,从而氨基化的反应,可能是由于细胞内乙醛的积累,抑制酵母细胞。进一步的研究可以直接调整co-substrate改善NADH BsAlaDH产生更多的可用性丙氨酸(丙酮酸的和更少的),而且还避免香荚兰醇的形成。gydF4y2Ba

3.3结合还原胺和酰胺化nonivamide生产gydF4y2Ba

应变TMBNM033被表达CaAT和IpfF进一步改造,先前证明是有效地从non-anoic nonivamide酸的生物合成和vanillylamine (gydF4y2BaMuratovska et al ., 2022 agydF4y2Ba)。所构造的酵母菌株TMBNM034,包含CvTA BsAlaDH,ΔADH6和CaAT / IpfF,特征是在实验室规模的nonivamide生物反应器生产香兰素和non-anoic酸(gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba)。酵母细胞最早是在有氧条件下种植与葡萄糖作为碳和能源;随后,基质香兰素和non-anoic酸补充道。在这一点上,细胞密度高(ODgydF4y2Ba_{620海里gydF4y2Ba}= 15 - 17)使更高的转化率。曝气被发现影响全细胞转氨作用反应消极,无论是vanillylamine形成和形成副产品(gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba)。另一方面,缺氧会导致供应有限的ATP和CoA-SH辅酶A连接酶生成所需的酰基辅酶amide-forming一步。解释为这个可能的困境,两个反应配置比较:(1)air-sparged条件(gydF4y2Ba图3 a, BgydF4y2Ba)和(2)non-sparged氧限制条件(gydF4y2Ba图3 c, DgydF4y2Ba)。提供的香兰素和non-anoic酸转化为nonivamide在这两种情况下,但稍微的氧气(0.19 vs 0.12μmol LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}ODgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})(gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba;gydF4y2Ba表3gydF4y2Ba)。结果表明,酰胺化确实可以结合在锅还原胺化酵母。然而,nonivamide浓度很低,一个重要的积累vanillylamine观察(3 - 5毫米),显示amide-forming一步是生产香兰素的瓶颈。可能会猜测,增加空气的生物反应器可能改善这种情况通过增加ATP和CoA-SH的供应;然而,其他问题也可以,gydF4y2Ba如。gydF4y2BaCaAT, IpfF酶的表达水平或特定的活动可能很低。non-anoic酸的可用性也可以限制因为它是补充由于毒性和低溶解度(在低浓度gydF4y2BaMuratovska et al ., 2022 agydF4y2Ba)。实验表明,gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba转氨作用反应是受到增加曝气反应的肉汤。vanillylamine比生成速率/副产品形成较高non-sparged条件下(3.5和2.4)。香草酸形成酒精和更是如此,香草酸,较低,导致摩尔收益率从使用香兰素为0.28±0.03,0.03±0.01分别为48 h。这表明ADH6删除不足以完全防止香荚兰酒精在应用条件下形成。然而,当乙醇同化并没有发现在厌氧条件下,它是消耗在整个生物转化与空气喷雾,指示功能再生的代数余子式。细胞生存能力,用流式细胞术,一直居高不下> 98%完整细胞的生物转化的条件(gydF4y2Ba补充图S3gydF4y2Ba在补充),无法解释观察到的不同的活动。gydF4y2Ba

4结论gydF4y2Ba

酿酒酵母gydF4y2Ba设计了生产香兰素的nonivamide和non-anoic酸。所构造的酵母菌株包含进行耦合的多酶的级联胺和酰胺形成步骤gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba。CvTA表达和NADH-dependent BsAlaDH一起ADH6淘汰赛,和使用乙醇作为co-substrate oxygen-limitation再生主要NADH青睐正式和还原胺化导致了几乎完全抑制内源性酶转换香草香草酸和香子兰的酒精。酰胺形成步骤使用CaAT / IpfF-cascade是两到三个数量级比氨基化效率较低,不过,功能是清楚的。发达的方法打开的可能性基于酵母生产香兰素的辣椒素,虽然需要更多的努力来提高效率。gydF4y2Ba

数据可用性声明gydF4y2Ba

最初的贡献提出了研究中都包含在这篇文章/gydF4y2Ba补充材料gydF4y2Ba,进一步的调查可以针对相应的作者。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

纳米进行实验、分析和起草了手稿。NM和MC设计研究,设计了实验,解释数据,写的手稿。gydF4y2Ba

资金gydF4y2Ba

这项研究是由瑞典研究理事会资助下拨款201704174。gydF4y2Ba

确认gydF4y2Ba

我们承认微生物工程集团的成员在化学系,隆德大学,进行富有成果的讨论在这个手稿的准备。我们想感谢拉奎尔Perruca-Foncillas提供pRP005质粒。gydF4y2Ba

的利益冲突gydF4y2Ba

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。gydF4y2Ba

补充材料gydF4y2Ba

本文的补充材料在网上可以找到:gydF4y2Bahttps://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fceng.2022.1097215/full补充材料gydF4y2Ba

引用gydF4y2Ba