比较聚对苯二甲酸乙二醇酯的酶解聚和AkestragydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba使用gydF4y2BaHumicola insolensgydF4y2BacutinasegydF4y2Ba

介绍gydF4y2Ba

根据最新的报告全球塑料前景(gydF4y2Ba经合组织,2022年gydF4y2Ba),塑料垃圾是到2060年一式三份,除非严重的政策实施。在报告中,同样清楚的是,低回收百分比和塑料废物管理不善,大大有助于塑料污染陆生、水生环境。因此,可持续发展成为基本的和高质量的回收方法。因此,酶促降解提供了一个强大的工具,可以在温和的条件下具有良好的特异性的酯键(gydF4y2Ba齐默尔曼和公平,2010gydF4y2Ba),导致高质量的化学物质和单体闭环回收应用程序(gydF4y2Ba魏和齐默尔曼,2017年gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

酶促降解技术,聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)是研究聚合物热点:超过15宠物水解酶,和更多的变体,描述到目前为止(gydF4y2BaQi et al ., 2021gydF4y2Ba)。然而,小说塑料使用biobased构建块,保留相当或更好的属性开始流行(gydF4y2BaHatti-Kaul et al ., 2020gydF4y2Ba),及其酶解聚作用还需要评估(gydF4y2BaArza et al ., 2019gydF4y2Ba;gydF4y2Ba王et al ., 2020gydF4y2Ba;gydF4y2Ba李et al ., 2021gydF4y2Ba)。在新开发的biobased聚酯,部分biobased聚合物AkestragydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba(Perstorp AB)提出了一种高gydF4y2BaTgydF4y2Ba_ggydF4y2Ba(90 - 110°C)和透明度,它显示了高潜力在各种应用程序中,如热灌装食品包装、瓶子、茶壶等。此前,Akestra酶治疗gydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba使用gydF4y2BaIdeonella sakaiensisgydF4y2BaPETase (gydF4y2Ba是gydF4y2BaPETase)和海洋宠物水解酶(PET2)显示只有0.13%的解聚作用(gydF4y2BaWagner-Egea et al ., 2021gydF4y2Ba),没有可检测解聚产品(gydF4y2BaWagner-Egea et al ., 2022gydF4y2Ba),分别。酶的过程都是在37°C (gydF4y2Ba是gydF4y2BaPETase)和55°C (PET2),温度明显低于Akestra的玻璃化转变温度gydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba。因此,这个因素是重要的对于一个有效的解聚。gydF4y2Ba

Humicola insolensgydF4y2Bacutinase (HiCut)的最佳温度为70°C (gydF4y2BaFabbri et al ., 2021gydF4y2Ba),可以执行更紧密地聚合物的玻璃化转变温度(gydF4y2BaTgydF4y2Ba_ggydF4y2Ba为宠物∼72°C, Akestra 90 - 110°CgydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba),无定形区域更容易被酶水解(gydF4y2Ba魏et al ., 2019gydF4y2Ba)。退化的一些研究已经进行使用宠物HiCut产生高降解率(gydF4y2BaRonkvist et al ., 2009gydF4y2Ba;gydF4y2BaMachado德卡斯特罗et al ., 2017gydF4y2Ba;gydF4y2BaMachado德卡斯特罗et al ., 2018gydF4y2Ba;gydF4y2BaMachado德卡斯特罗et al ., 2019gydF4y2Ba;gydF4y2Ba德奎罗斯Eugenio et al ., 2021gydF4y2Ba)和摘要共聚物(gydF4y2BaDi Bisceglie et al ., 2022gydF4y2Ba)。与其他cutinases相比,HiCut表现出良好的性能在降解聚酯与其他biobased芳香单位如呋喃或噻吩单元(gydF4y2Ba温伯格et al ., 2017gydF4y2Ba;gydF4y2Ba吉利et al ., 2019gydF4y2Ba)。在此,商业聚酯Akestra biocatalytic退化gydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba是第一次了。此外,分子对接HiCut宠物和AkestragydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba和分子动态模拟提供了洞察酶/配位体的相互作用包括灵活的配体影响构象稳定预测循环。gydF4y2Ba

材料和方法gydF4y2Ba

化学物质,酶和聚合物gydF4y2Ba

所有化学药品和试剂都购买,从Sigma-Aldrich最高纯度。的商业液体制剂gydF4y2BaHumicola insolensgydF4y2Bacutinase (HiCut)从诺维信(产品Novozym购买gydF4y2Ba^®gydF4y2Ba51032)。gydF4y2Ba

无定形宠物电影是购自格拉汉姆·古德费勒(产品编号es30 - fm - 000145), RamaPET N180从Indorama AkestragydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba由Perstorp AB。叫粉聚合物准备通过dissolution-precipitation预处理(如前所述)(gydF4y2BaWagner-Egea et al ., 2021gydF4y2Ba)。在这项研究中使用的聚合物的物理性质进行了总结gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

此外,根据制造商,AkestragydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba90年20 mol %含量spiroacetal单位,而AkestragydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba110年45摩尔%(对对苯二甲酸乙二醇酯单元)。gydF4y2Ba图1gydF4y2Ba显示了两terephthalate-based聚酯的结构评估。gydF4y2Ba

蛋白质特性:纯度、浓度和热稳定性gydF4y2Ba

商业HiCut的浓度取决于bicinchoninic酸(BCA)方法后,设备制造商协议(西格玛奥德里奇BCA1),获得股票53.5 g / L的浓度。此外,使用预制的12% sds - page分析丙烯酰胺凝胶(Bio-Rad)没有退化的迹象,和主要的蛋白质制备的摩尔质量的约20 kDa,与理论上计算分子量一致。批处理的活动确定了用于344±31 U /毫升,用pNP-butyrate衬底(补充信息,gydF4y2Ba补充图S1gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

热稳定性评价是差示扫描荧光测定术(DSF)使用普罗米修斯NT 48 nano DSF (NanoTemper GmbH是一家现代化的、可靠的技术,德国慕尼黑)。一式三份样品1毫克/毫升HiCut,有或没有CaCl 1毫米gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba,准备在1 M 50µL Tris-HCl缓冲区。分析的样本加热从20到90°C的速度每分钟1°C。蛋白质展开监测通过测量固有荧光发射波长的330和350海里。gydF4y2Ba

酶促反应gydF4y2Ba

反应是由浸泡20毫克的聚合物在1米2毫升Tris-HCl缓冲pH值为7.5,10% (v / v)二甲亚砜(DMSO)和0.085毫克/毫升的酶(gydF4y2BaRonkvist et al ., 2009gydF4y2Ba;gydF4y2BaWagner-Egea et al ., 2021gydF4y2Ba)。一式三份,包括消极的控制(没有酶反应混合物),孵化在70°C和235 h。200 rpm样本在不同时期被稀释200µL样本检索500年µL DMSO, 0.2µm PES无菌过滤膜,转移到玻璃小瓶进行进一步的高效液相色谱分析。对于粉末聚合物的反应,第二个需要在DMSO溶液稀释。gydF4y2Ba

高效液相色谱法和质分析gydF4y2Ba

分析了酶促降解反应的产物通过高效液相色谱法(HPLC)和液相色谱-光谱法(质)与前面描述的方法(gydF4y2BaWagner-Egea et al ., 2021gydF4y2Ba)。使用高效液相色谱法是一种终极3000 RS (Dionex)配备了UV / Vis检测器(SPD-20A)和质是一种终极3000 RS HPLC-system (ThermoFisher科学)加上一个LTQ Velos Pro离子阱质量范围(ThermoFisher科学)使用激烈的电喷雾电离源(HESI-II)。紫外线的波长设置为260 nm,女士是在负模式操作,在m / z 50 - 700的质量范围。HESI-source温度设置为300°C,和喷雾电压为3.0伏特。氦是用作碰撞气体,气体和氮气作为喷洒。质/女士进行了使用数据采集(DDA)的依赖和CID分散能源的35%。疏水C18柱(KinetexgydF4y2Ba^®gydF4y2Ba1.7μm XB-C18 100 A, LC Column50×2.1毫米),和一个20 - 80%的混合物组成的流动相乙腈和甲酸(0.1%),分别为。流量是固定在0.4毫升/分钟3分钟/样品。对某些试验程序扩展到20分钟,来验证该列的本事,寻找额外的降解产物。相同的一直流,和标准条件举行了8分钟,然后移动阶段(乙腈)上升至50% (B阶段是甲酸0.1%)超过1分钟,在这举行水平4分钟,然后在1分钟,最后回到20%,下降的起始条件举行另一个6分钟。gydF4y2Ba

傅里叶变换红外光谱学gydF4y2Ba

剩余的宠物和AkestragydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba都是电影和粉末,从192 h的酶促反应,用洗涤剂洗净,用超纯水冲洗,干燥气流下离开了。然后,红外光谱样本,记录在4厘米的一项决议gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}在NicoletTMiSTM5红外光谱谱仪(热费希尔科学)。与OMINIC软件进行数据分析。gydF4y2Ba

表面电子显微镜成像gydF4y2Ba

宠物和Akestra的表面形态gydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba电影192 h后的酶反应检测表面电子显微镜(SEM)地产- 6700 f (JEOL)模型在一个加速10千伏的电压。样本,包括消极的控制,被溅射涂上一层15海里的Au / Pd提供足够的导电性。gydF4y2Ba

核磁共振光谱学gydF4y2Ba

AkestragydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba样品溶解在CDClgydF4y2Ba_3gydF4y2Ba并受核磁共振(NMR)谱分析,进行碳频率为100.61 MHz X400光谱仪博士在力量。gydF4y2Ba

分子对接和分子动力学模拟gydF4y2Ba

探讨酶(受体)和基质之间的相互作用(配体),进行分子对接HiCut宠物和AkestragydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba。使用的配体是mono(羟乙基)对苯二甲酸乙二醇酯二聚体(MHET)gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba(gydF4y2BaWagner-Egea et al ., 2022gydF4y2Ba)和terephthalate-spiroglycol酯(TPA-spiroglycol) (gydF4y2Ba图4 bgydF4y2Ba)。HiCut以前的晶体结构解析(gydF4y2Ba克尔德et al ., 2014gydF4y2Ba3.00)和三维结构的解析存入蛋白质数据银行,加入4 oyy代码。然后,配体和酶对接使用七弦琴Autodock (gydF4y2BaTrott奥尔森,2010gydF4y2Ba)实现YASARA (gydF4y2BaKrieger et al ., 2002gydF4y2Ba),与视觉分析在加州嵌合体v 1.15 (gydF4y2Ba佩特森工作室内由手工制作完成et al ., 2004gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

选择best-docked复合物后,分子动力学(MD)模拟进行YASARA (gydF4y2BaKrieger Vriend, 2015gydF4y2Ba)。MD模拟条件包括pH值7.4,0.9%的氯化钠,0.97774克/毫升水密度,并为50 ns 343 K。模拟快照保存每250 ps。模拟细胞是一个立方体10与周期性边界周围的所有原子。使用的力场AMBER14 (gydF4y2Baet al ., 2014年gydF4y2Ba),长程库仑力。详细的轨迹中的分析和结合能的计算进行了利用Poisson-Boltzmann和表面积溶解(毫米/ PBSA)方法(gydF4y2BaGenheden莱德,2015gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

差示扫描量热法gydF4y2Ba

助教仪器DSC Q2000用于热性能分析和结晶度。宠物和Akestra(电影和粉末)酶促降解前进行了分析。非晶样品从室温加热到200°C的速度10°C /分钟和宠物粉从室温加热到300°C 10°C /分钟的速度下氮清洗率50毫升的分钟gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}。宠物粉末的结晶度是根据之前报道来计算方法(gydF4y2BaWagner-Egea et al ., 2021gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

结果与讨论gydF4y2Ba

HiCut热稳定性gydF4y2Ba

融化温度(TgydF4y2Ba_米gydF4y2BaHiCut),缓冲Tris-HCl pH值7.5,是80°C的DMSO和77°C的10% DMSO (gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba)。在此之前,gydF4y2Ba贝克et al . (2012gydF4y2Ba)公布TgydF4y2Ba_米gydF4y2BapH值为62.7°C(8)和64.3°C (pH值5)磷酸钠和醋酸钠缓冲,分别。这种高度显示缓冲区组成和pH值用于这项工作更适合HiCut耐热性。添加10% DMSO减少HiCut TgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba只有在3°C,这表明70°C是一个适合执行反应以10% DMSO溶液的温度。另一方面,额外的CaClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba1毫米没有任何明显影响HiCut的热稳定性。gydF4y2Ba

解聚反应产品和概要文件gydF4y2Ba

HiCut解聚的宠物产品,由高效液相色谱,是对苯二甲酸(TPA)∼0.61分钟,mono(羟乙基)对苯二酸酯(MHET)∼0.76分钟,和bis(羟乙基)对苯二酸酯(BHET)∼保留时间0.96分钟(gydF4y2Ba图3一gydF4y2Ba)。这些产品经质(补充信息,gydF4y2Ba补充图S6gydF4y2Ba)。此外,洗脱峰DMSO和TPA之间被确认为三,一个组件的缓冲区用于反应混合。前9 h反应,主要产品包括MHET少量BHET和TPA,而后来的(192 h),主要产品是TPA。这个结果表明HiCut可以进一步降低MHET TPA,据其他人(gydF4y2BaRonkvist et al ., 2009gydF4y2Ba;gydF4y2BaMachado德卡斯特罗et al ., 2019gydF4y2Ba;gydF4y2Ba德奎罗斯Eugenio et al ., 2021gydF4y2Ba;gydF4y2BaKaabel et al ., 2021gydF4y2Ba)。在相对纯粹的TPA的主要产品是非常可取的,因为它是一个单体,可直接用于宠物的re-polymerization (gydF4y2BaWierckx et al ., 2015gydF4y2BaAkestra等)或其他聚合物的合成gydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba或其他增值产品(gydF4y2Ba罗伊et al ., 2013gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

HiCut Akestra解聚的两种等级的货gydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba90年和110年,TPA和MHET在第一个小时的反应,但是后来,48 h后,主导产品是TPA (gydF4y2Ba图3 b, CgydF4y2Ba)。质产品分析的反应(192 h),随着时间较长的分析,显示了TPA峰(gydF4y2Ba图4一gydF4y2Ba),第二个峰的保留时间为14.3分钟,确认为TPA-spiroglycol酯(gydF4y2Ba图4 bgydF4y2Ba),这表明HiCut水解TPA-spiroglycol酯键是无效的(gydF4y2Ba图4 cgydF4y2Ba)。进一步水解产物(spiroglycol)没有检测到。gydF4y2Ba

宠物和Akestra HiCut活动gydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba

宠物和Akestra HiCut活动gydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba评估是对苯二甲酸浓度(毫克/升)的等价物(TPAeq)产生。高效液相色谱量化(补充信息,gydF4y2Ba补充图S2gydF4y2Ba和gydF4y2Ba补充表S1gydF4y2Ba),产品MHET和BHET视为TPAeq,假设相同的摩尔消光系数gydF4y2BaεgydF4y2Ba= 17000gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}厘米gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}芳环的授予。因此,无定形宠物电影达到了产品的降解浓度为615.2 mg / L,而AkestragydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba电影退化仅为30.6 mg / L (gydF4y2Ba图5一个gydF4y2Ba)。如果非晶粉末(gydF4y2Ba图5 bgydF4y2Ba),HiCut产生了1270.3、3829.3和746.3 mg / L TPAeq宠物,AkestragydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba90年,AkestragydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba110年,分别为(gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba)。应该注意的是,酶解聚率聚酯可以受到许多内在因素的聚合物(如化学结构、gydF4y2BaTgydF4y2Ba_ggydF4y2Ba、结晶度、分子量、样品的物理形式)和外部因素(如酶的选择、温度、pH值,等等)。因此而具有挑战性的孤立一个特定因素的影响,得出有意义的结论基于有限的实验。在这项工作中,我们具体的结果看似相似的样品相比,旨在提供洞察力。当两个不同等级的Akestra粉末gydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba90年和110年进行比较(gydF4y2Ba图5 bgydF4y2Ba观察到Akestra),这是有趣的gydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba90显示解聚率显著高于AkestragydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba110年。这两个样品有相同的物理形式(粉末),结晶度(完全非晶)和类似的分子量(反映在他们的类似IV值,0.64和0.63∼-0.67∼Akestra dl / ggydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba90年和110年分别gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba),所以大他们的解聚率的差异可以归因于他们的差异gydF4y2BaTgydF4y2Ba_ggydF4y2Ba和化学结构。AkestragydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba90年低gydF4y2BaTgydF4y2Ba_ggydF4y2Ba比AkestragydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba110,这是一个因素,据报道,加强其他酶解聚作用(gydF4y2BaCarniel et al ., 2021gydF4y2Ba)。此外,AkestragydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba110也有较高含量的spiroglycol单位比Akestra(45∼摩尔%)gydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba90 (∼20 mol %,根据供应商),这可能影响酶促降解的速度根据文献(gydF4y2Ba胡锦涛等人。,2021年gydF4y2Ba)。此外,两个AkestragydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba(90和110)粉也有不同的分布结构二分体和单体序列的长度(补充信息,gydF4y2Ba补充图S3gydF4y2Ba如图所示),通过多个芳香或羰基的存在gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC信号(gydF4y2Ba8gydF4y2Ba(Ar-CH),gydF4y2Ba9gydF4y2Ba(Ar-C)和gydF4y2Ba10gydF4y2Ba(C = O)(补充信息,gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC NMR AkestragydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba90年和110年,gydF4y2Ba补充数据S4A-CgydF4y2Ba)。这个因素可能造成的影响的酶促降解率两个AkestragydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba聚酯仍瓦解(gydF4y2BaJapu et al ., 2012gydF4y2Ba;gydF4y2BaLavilla et al ., 2012gydF4y2Ba;gydF4y2BaKupczak et al ., 2021gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

当宠物粉两Akestra相比gydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba粉,更复杂,因为宠物不仅不同于AkestragydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba在他们的化学结构gydF4y2BaTgydF4y2Ba_ggydF4y2Ba,而且结晶度。原则上,获得的低降解产物与宠物粉,而AkestragydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba90年,可能与11%的结晶度,限制了访问聚合物链解聚作用(gydF4y2Ba韦伯et al ., 2012gydF4y2Ba)。以前,其他作者也报道的性能下降HiCut半晶状的聚合物(gydF4y2BaRonkvist et al ., 2009gydF4y2Ba;gydF4y2Ba温伯格et al ., 2017gydF4y2Ba;gydF4y2BaMachado德卡斯特罗et al ., 2019gydF4y2Ba),使其成为实现这种酶的主要缺点。同时,低gydF4y2BaTgydF4y2Ba_ggydF4y2Ba的宠物Akestra相比gydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba110可能是主导因素,导致观察到的稍快解聚率的宠物粉比AkestragydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba110粉(gydF4y2Ba图5 bgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

当比较两个电影的降解率(宠物Akestra,gydF4y2Ba图5一个gydF4y2Ba),显然宠物电影显示,降解速率快得多。两个样品都是完全非晶,但很大程度上的不同gydF4y2BaTgydF4y2Ba_ggydF4y2Ba和化学结构。较低的gydF4y2BaTgydF4y2Ba_ggydF4y2Ba的宠物比Akestra (73°C)gydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba电影(102°C)可能是一个重要因素,导致更高的宠物退化。其他结构的可能影响因素,如spiroacetal单位和分子量的存在,仍然被瓦解。gydF4y2Ba

除了AkestragydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba电影,根据一阶动力学实验数据拟合的共存足够的衬底(20毫克的聚合物2毫升),到下一个方程(gydF4y2BaMiyawaki et al ., 2017gydF4y2Ba)找到明显的失活速率常数gydF4y2Ba ${\mathrm{一个gydF4y2Ba}}_{\mathrm{年代gydF4y2Ba}}^{\mathrm{一个gydF4y2Ba}\mathrm{pgydF4y2Ba}\mathrm{pgydF4y2Ba}}$ :gydF4y2Ba

在哪里gydF4y2Ba $\left[\mathrm{PgydF4y2Ba}\right]$ 降解产物的浓度,gydF4y2Ba $\left[\mathrm{EgydF4y2Ba}\right]$ 是酶的浓度(0.085毫克/毫升),gydF4y2Ba ${\mathrm{kgydF4y2Ba}}_{\mathrm{年代gydF4y2Ba},gydF4y2Ba\mathrm{0gydF4y2Ba}}^{\mathrm{一个gydF4y2Ba}\mathrm{pgydF4y2Ba}\mathrm{pgydF4y2Ba}}$ 和gydF4y2Ba ${\mathrm{kgydF4y2Ba}}_{\mathrm{年代gydF4y2Ba}}^{\mathrm{一个gydF4y2Ba}\mathrm{pgydF4y2Ba}\mathrm{pgydF4y2Ba}}$ 是最初的酶活性在给定的时间和积分形式描述了明显的饱和曲线。在gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba总结了动力学常数,计算总降解产物经过235小时的反应时间和解聚的百分比,由总降解产物考虑最初的20毫克的聚合物。gydF4y2Ba

从动力学常数和饱和曲线,可以得出这样的结论:gydF4y2BaHumicola insolensgydF4y2Bacutinase具有较高的初始活动(gydF4y2Ba ${\mathrm{KgydF4y2Ba}}_{\mathrm{年代gydF4y2Ba}}^{\mathrm{一个gydF4y2Ba}\mathrm{pgydF4y2Ba}\mathrm{pgydF4y2Ba}}$ )对于AkestragydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba但达到饱和速度比宠物。在这种情况下,饱和不是归因于完成反应酶的失活。以前,德奎罗斯Eugenio et al。(2021)表明,宠物降解产物对HiCut没有抑制作用,但AkestragydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba,自由TPA-spiroglycol结构可能对酶造成负面影响。gydF4y2Ba

最后,应该注意的是,商业聚酯PET通常包含几个百分点的环状低聚物。此外,酶促降解的聚酯(水解)也可能导致不同的寡聚物的形成,甚至微型飞行器或纳米级粒子之前他们终于变成了TPA。确切的退化过程可能是复杂和多样化,根据条件和聚合物的性质。本文仅旨在获得初步了解最后TPA产品的产量,与聚合物和相关酶的结构。虽然我们现在还没有观察到任何寡聚物在我们的实验结果,这不能排除低聚物(那些最初出现在材料或中间降解产物)没有发现由于其水溶解度较低。在未来,深入洞察寡聚物的降解机制包括可能影响可能通过使用有机溶剂萃取反应的介质(gydF4y2BaTsochatzis et al ., 2020gydF4y2Ba;gydF4y2BaDiamantidou et al ., 2022gydF4y2Ba)。此外,可能形成或微观纳米级粒子退化时也会是一个有趣的研究。gydF4y2Ba

扫描电子显微镜分析gydF4y2Ba

AkestragydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba和无定形的宠物电影HiCut对待192年由SEM分析了h (gydF4y2Ba图6gydF4y2Ba)。未经处理的电影(控制)在两种聚合物,表面光滑,而酶治疗宠物显示颗粒和不规则的表面,和酶Akestra治疗gydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba电影展示了大裂缝。这些结果表明,酶作用主要表面的电影和证实表面侵蚀过程(gydF4y2Ba米勒,2006gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

红外光谱分析gydF4y2Ba

红外光谱是用来描述聚合物电影或粉末后酶治疗。所有的光谱(补充信息,gydF4y2Ba补充图S5gydF4y2Ba)规范化使用小峰在1410厘米gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}(苯环振动)作为参考(Drobota et al ., 2013)。一般来说,宠物的所有特征峰(如1714、1240、1093、1016、870和720厘米gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})和AkestragydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba(例如,1201和1163厘米gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}后)仍然可见HiCut治疗(gydF4y2Ba图7 a egydF4y2Ba)。粉末的宠物,AkestragydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba90年和110年,AkestragydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba110年的电影,减少红外光谱峰的强度在720年,1093年和1240厘米gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}(gydF4y2Ba图7gydF4y2Ba酶治疗后观察,负控制样品相比,符合表面退化的发生(gydF4y2BaIoakeimidis et al ., 2016gydF4y2Ba)。宠物电影(gydF4y2Ba图7 dgydF4y2Ba),没有观察到显著差异相比,酶处理后的红外光谱谱控制样本,表明其降解速率相对较慢。gydF4y2Ba

分子对接和分子动力学gydF4y2Ba

HiCut之间的相互作用和hydrolysable (MHET)gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba分子对接和non-hydrolysable TPA-spiroglycol配体进行了研究。的分子结构gydF4y2Ba腐皮镰孢霉菌gydF4y2Bacutinase(56%序列身份)(gydF4y2Ba马丁内斯et al ., 1992gydF4y2Ba),HiCut股票守恒的催化三、Ser105, His173, Asp160,和稳定的oxyanion洞,负电荷在羰基氧过渡状态。gydF4y2Ba

最初,对接显示(MHET)gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba与羰基TPA-spiroglycol与HiCut面向催化氨基酸和oxyanion孔(gydF4y2Ba图8 a, BgydF4y2Ba)。配体四周都是疏水性氨基酸,Leu66, Phe70 Leu167, Ile169,主要在相对应的子站终端对苯二甲酸乙二醇酯一半。疏水性氨基酸的存在在其他宠物活跃的酶的催化部位(gydF4y2Ba罗斯et al ., 2014gydF4y2Ba;gydF4y2BaSulaiman et al ., 2014gydF4y2Ba;gydF4y2BaKitadokoro et al ., 2019gydF4y2Ba)也强调与聚酯的重要特征。相对应的子站乙二醇和第二TPA的情况(MHET)gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba(gydF4y2Ba图8gydF4y2Ba),spiroglycol TPA-spiroglycol (gydF4y2Ba图8 bgydF4y2Ba),四周都是Leu174 Tyr104,极性氨基酸Thr29, Glu30, Thr37。与配体的交互(MHET)gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba两个T-stacking似乎喜欢交互,Phe70 Tyr104,与芳香TPA戒指。当配体与Phe70 TPA-spiroglycol显示只有一个。此外,分子动态模拟显示构象变化,无法支持HiCut / TPA-spiroglycol交互。gydF4y2Ba

两种复合物,HiCut / (MHET)gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba和HiCut / TPA-spiroglycol, HiCut自由配体受到的分子动力学模拟。模拟条件包括70°C, pH值为7.4,0.9%氯化钠离子50 ns。轨迹的分析显示一个重要变化的均方根(RMSD)α碳原子的位置,在自由酶(1.6gydF4y2Ba图9gydF4y2Ba)。然而,复合物HiCut / (MHET)gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba和HiCut / TPA-spiroglycol显示显著降低RMSD值,分别平均为0.8和0.9 (gydF4y2Ba图9gydF4y2Ba)。这些结果表明,这两种配体稳定酶的构象变化。的确,α碳原子的均方根波动(RMSF)分析显示循环α8——α9位于活性部位遭受构象变化(gydF4y2Ba图9 bgydF4y2Ba),主要在Asp160、His173 Ile169, Leu174。两个配体稳定该地区一个α螺旋的形式(gydF4y2Ba图9 b, CgydF4y2Ba)。也显著的构象变化配体TPA-spiroglycol,羰基氧的向着对面的一侧oxyanion洞和催化三分子(gydF4y2Ba图9 bgydF4y2Ba反应),指示一个不利的构象。催化Ser105之间距离的波动和羰基碳的配体(gydF4y2Ba图8 bgydF4y2Ba)表明酯酶的活动发生在第二单元的酯键(MHET)gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba,对应于spiroglycol一半TPA-spiroglycol配体,解释其水解的不可能。这些结果与上面讨论的实验证据是一致的有关质分析。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

Humicola insolensgydF4y2Bacutinase (HiCut)迄今为止唯一的酶能够有效降解聚合物Akestra的小说gydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba报道,它的性能,对于其他polyester-degrading酶,是高度依赖gydF4y2BaTgydF4y2Ba_ggydF4y2Ba和聚合物的结晶度。这一特点的主要缺点是酶解聚,因为许多聚酯(例如,宠物)用于消费产品有很高的水晶百分比,探索合适的预处理方法可以提高酶的作用。对接和分子动力学模拟,与实验数据,表明HiCut能力解聚AkestragydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba收益率对苯二甲酸酯对苯二甲酸和spiroglycol。积木都是高价值的re-polymerization相同或不同的聚酯或其他产品的合成。最后,这些结果可能为未来的过程开发和优化研究的基础。gydF4y2Ba

数据可用性声明gydF4y2Ba

最初的贡献提出了研究中都包含在这篇文章/gydF4y2Ba补充材料gydF4y2Ba,进一步的调查可以针对相应的作者。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

JL-P商务设计研究。LA-L执行大部分的实验和写草案的手稿。SM和CT进行实验。所有作者分析了数据,参与修订手稿,并批准。JL-P和BZ获得研究基金。JL-P管理这个项目。gydF4y2Ba

资金gydF4y2Ba

这项研究是由Crafoord基金会资助(批准号2020 - 0774),英国皇家地形学的社会在隆德,瑞典可持续发展研究委员会(简称Formas,没有。2021 - 01107年)和Mistra基金会(“步骤”项目,没有。2016/1489)。gydF4y2Ba

的利益冲突gydF4y2Ba

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。gydF4y2Ba

补充材料gydF4y2Ba

本文的补充材料在网上可以找到:gydF4y2Bahttps://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fceng.2022.1048744/full补充材料gydF4y2Ba

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