简短的研究报告的文章

前面。细胞Dev。杂志。,19 January 2023
秒,分子和细胞病理学
卷11 - 2023 | https://doi.org/10.3389/fcell.2023.1116128

简短的研究报告:捏缺乏对软骨的影响在成年小鼠体内平衡

Xiaohao吴 ¹ ^__*,

Sixiong林 ² ^__,

Rongdong廖 ³, www.雷竞技rebatfrontiersin.org

清么¹,

一派林³,

被罢免邹 ²和

Guozhi肖 ¹*

¹生物化学系、深圳重点实验室的细胞微环境,广东省重点实验室的细胞微环境和疾病研究,医学院的南方科技大学,深圳,中国
²广东省重点实验室骨科创伤学、脊柱外科、中山大学第一附属医院,广州,中国
³南方医科大学珠江医院骨科,,广州,中国

Pinch1和Pinch2 LIM domain-containing蛋白质具有重要功能的调节焦点粘连的形成。我们先前的研究已经表明,Pinch1/2表达式是必不可少的软骨和骨形成在老鼠的骨骼发展。压力损失表达式(这种破坏^Cre;Pinch1^{液氧/液氧};Pinch2^−−/)抑制软骨细胞增殖,促进软骨细胞凋亡,导致严重的软骨发育异常和肢体缩短。根据这些观察,我们想知道捏蛋白质有一个角色在成人软骨和软骨内稳态压力缺乏是否会妥协,促进骨关节炎(OA)在成年小鼠相关的缺陷。为此,我们生成Aggrecan^CreERT2;Pinch1^{液氧/液氧};Pinch2^−−/老鼠,Pinch1 aggrecan-expressing软骨细胞的基因可以被诱导删除它莫西芬和全球Pinch2基因灭活。Immunofluorescent染色证实,捏蛋白的表达明显减少成人Aggrecan服用它莫西芬的关节软骨^CreERT2;Pinch1^{液氧/液氧};Pinch2^−−/老鼠。意外,我们的结果表明,压力损失并没有导致关节软骨和其他明显异常联合组织的膝关节岁成年小鼠(10个月大)或(17个月大)老鼠。内侧半月板的扰动(DMM)全身的营运模式,surgically-induced OA病变是Pinch-deficient老鼠和控制老鼠之间的可比性。鉴于捏蛋白质是必不可少的在骨骼发育形成软骨形成和软骨,这些发现表明,压力表达式是看似不不可或缺的成年小鼠软骨内稳态。

介绍

Pinch1和Pinch2进化保守蛋白质,含有五cysteine-rich LIM域调解蛋白质-蛋白质之间的关系(图et al ., 1999)。捏蛋白质与整合素连接激酶(同类)和帕文形成heterotrimeric ILK-Pinch-parvin (IPP)复杂(使节et al ., 2006)。IPP复杂结合的胞质尾细胞外基质(ECM)的结扎整合蛋白和链接到肌动蛋白细胞骨架,以促进cell-ECM粘连(Wickstrom et al ., 2010)。据报道,捏的蛋白质参与多个基本的细胞过程,如粘着斑(FA)的形成,细胞骨架组织,细胞增殖,迁移和生存(福田et al ., 2003;酒井法子et al ., 2003;李et al ., 2005;梁et al ., 2005;陈et al ., 2008;徐et al ., 2016)。全球Pinch1基因的缺陷(Pinch1^−−/老鼠)是致命的(梁et al ., 2005),而全球Pinch2-null (Pinch2^−−/()老鼠显示没有明显的异常Stanchi et al ., 2005)。我们组的结果表明,压力损失的蛋白质会导致严重缺陷小鼠在多个器官和组织(王et al ., 2019;Lei et al ., 2020;高et al ., 2021)。例如,压力不足Dmp1-expressing骨细胞影响骨形成和吸收之间的平衡,导致严重的骨量减少小鼠的表型(王et al ., 2019)。更重要的是,我们已经表明,压力损失表达式间叶细胞祖细胞(这种破坏^Cre;Pinch1^{液氧/液氧};Pinch2^−−/)会导致严重的骨头和软骨缺陷在骨骼发育,包括小体型、肢体缩短,软骨发育异常,老鼠和骨量减少,(Lei et al ., 2020)。在生长板软骨,压力损失蛋白质显著抑制软骨细胞增殖,提高软骨细胞凋亡,并破坏软骨细胞柱的形成。这些发现表明,捏在调节软骨形成蛋白质发挥重要作用在骨骼和软骨的形成发展。

根据这些观察,我们怀疑捏蛋白质有一个角色在成人关节软骨和软骨内稳态压力缺乏是否会妥协,促进骨关节炎(OA)在成年小鼠相关的缺陷。为此,我们生成Aggrecan^CreERT2;Pinch1^{液氧/液氧};Pinch2^−−/老鼠,Pinch1 aggrecan-expressing软骨细胞的基因可以被诱导删除它莫西芬和全球Pinch2基因灭活。Pinch1/2删除成人关节软骨的影响以及其他联合组织和OA-related分数定量确定自发和surgically-induced OA模型。

结果

代Aggrecan^CreERT2;Pinch1^{液氧/液氧};Pinch2^−−/老鼠

调查是否夹在成人软骨蛋白有一个角色,我们生成Aggrecan^CreERT2;Pinch1^{液氧/液氧};Pinch2^−−/通过穿越Aggrecan老鼠^CreERT2小鼠液氧Pinch1 (Pinch1^{液氧/液氧})小鼠和Pinch2-null (Pinch2^−−/)小鼠,如示图1一个。在2个月的年龄,男性Aggrecan^CreERT2;Pinch1^{液氧/液氧};Pinch2^−−/老鼠管理5每天腹腔注射它莫西芬(100毫克/公斤体重,溶解在玉米油)诱导Pinch1 aggrecan-expressing软骨细胞中删除。值得注意的是,与男性Aggrecan^CreERT2;Pinch1^{液氧/液氧};Pinch2^−−/老鼠用玉米油和治疗作为对照组。Immunofluorescent染色分析表明,在他莫昔芬治疗后1周,Pinch1的表达明显减少关节软骨细胞服用它莫西芬的老鼠,比那些corn-oil-treated控件(图1 b, C)。自从Pinch2 Aggrecan全球基因灭活^CreERT2;Pinch1^{液氧/液氧};Pinch2^−−/老鼠;正如所料,Pinch2几乎没有检测到的表达在两组关节软骨细胞(图1 b, D)。

图1

图1。代Aggrecan^CreERT2;Pinch1^{液氧/液氧};Pinch2^−−/老鼠。(一)模式显示Aggrecan繁殖的^CreERT2;Pinch1^{液氧/液氧};Pinch2^−−/老鼠。它莫西芬被用来诱导Pinch1删除aggrecan-positive软骨细胞在丽江Aggrecan^CreERT2;Pinch1^{液氧/液氧};Pinch2^−−/老鼠。玉米油是用作控制它莫西芬治疗。(B)免疫荧光染色,图像显示了Pinch1和Pinch2蛋白的表达在膝关节的关节软骨。酒吧规模:200μm。(c - d)百分比的Pinch1 -和Pinch2-positive软骨细胞在三苯氧胺和玉米油Aggrecan^CreERT2;Pinch1^{液氧/液氧};Pinch2^−−/老鼠,分别。注意:N = 6为每组小鼠。结果表示为平均值±标准偏差(其中)。* * *p< 0.001;* * * *p< 0.0001。

Pinch1/2损失并不引起明显异常在成年小鼠膝关节

确定Pinch1/2不足可能导致成人关节软骨结构异常,男性Aggrecan六个2个月大^CreERT2;Pinch1^{液氧/液氧};Pinch2^−−/老鼠用他莫昔芬治疗。六个年龄Aggrecan^CreERT2;Pinch1^{液氧/液氧};Pinch2^−−/老鼠用玉米油作为控制。八个月后,所有老鼠都牺牲了,膝关节样本收集(图2一个)。Immunofluorescent染色分析证实,Pinch1的蛋白表达明显减少小鼠服用它莫西芬的关节软骨,与控制小鼠相比图2 b)。我们红色染料O和快速执行绿色染色和定量组织学分析评估关节结构和OA-related参数,包括OARSI(骨关节炎研究学会国际)得分,软骨,滑膜炎评分、骨赘的分数。结果显示无显著差异在关节软骨和其他联合组织,包括生长板软骨、滑膜和半月板(图2 c)。此外,可比他莫昔芬- OA-related参数和玉米油Aggrecan^CreERT2;Pinch1^{液氧/液氧};Pinch2^−−/老鼠(图2 d)。

图2

图2。Pinch1/2损失并不引起明显异常在成年小鼠膝关节。(一)模式说明实验设计。(B)免疫荧光染色Pinch1的关节软骨。酒吧规模:200μm。(C)代表红色染料O和快速green-stained膝关节部分的图像从它莫西芬-或玉米油Aggrecan^CreERT2;Pinch1^{液氧/液氧};Pinch2^−−/老鼠在10个月大的时候。高放大图像低面板显示关节软骨、增长板软骨、滑膜和半月板。酒吧规模:200μm。(d)定量组织学分析OARSI(骨关节炎研究学会国际)得分,软骨,滑膜炎得分,并使用膝关节部分骨赘的分数。注意:N = 6为每组小鼠。结果表示为平均值±标准偏差(其中)。ns:不重要。

Pinch1/2损失并不促进老年小鼠的OA的缺陷

接下来,我们测试如果Pinch1/2缺乏能促进老年小鼠的自发OA的缺陷。简单地说,男性Aggrecan六个2个月大^CreERT2;Pinch1^{液氧/液氧};Pinch2^−−/小鼠服用它莫西芬,另一个六的同龄Aggrecan^CreERT2;Pinch1^{液氧/液氧};Pinch2^−−/老鼠用玉米油。在17个月的年龄,所有的老鼠都牺牲了,膝关节样本收集(图3一)。Pinch1表达明显减少小鼠服用它莫西芬的关节软骨,而控制老鼠(图2 b)。组织学分析显示在膝关节和OA-related参数无显著改变它莫西芬,玉米油组(图3 c g)。

图3

图3。Pinch1/2损失并不促进老年小鼠的OA的缺陷。(一)模式说明实验设计。(B)免疫荧光染色Pinch1的关节软骨。酒吧规模:200μm。(C)代表红色染料O和快速green-stained膝关节部分的图像从它莫西芬-或玉米油Aggrecan^CreERT2;Pinch1^{液氧/液氧};Pinch2^−−/老鼠在17个月的年龄。高放大图像低面板显示关节软骨、增长板软骨、滑膜和半月板。酒吧规模:200μm。(d)定量组织学分析OARSI得分,软骨,滑膜炎得分,并使用膝关节部分骨赘的分数。注意:N = 6为每组小鼠。结果表示为平均值±标准偏差(其中)。ns:不重要。

Pinch1/2损失不会加剧手术诱导OA病变老鼠

接下来,我们调查是否Pinch1/2不足可能会加剧OA内侧半月板损伤的不稳定(DMM) OA的小鼠模型。六个2个月大的雄性Aggrecan^CreERT2;Pinch1^{液氧/液氧};Pinch2^−−/小鼠服用它莫西芬,另一个六的同龄Aggrecan^CreERT2;Pinch1^{液氧/液氧};Pinch2^−−/老鼠用玉米油。一周后,所有老鼠受到DMM手术。DMM手术十周后,所有老鼠都牺牲了,膝关节样本收集(图4一)。Pinch1表达明显减少小鼠服用它莫西芬的关节软骨,而控制老鼠(图2 b)。组织学分析表明,DMM手术成功诱导多个OA病变,包括软骨退化和骨赘的形成(图4 c);尽管如此,OA病变的严重程度相当它莫西芬-和玉米油组(图4 d)。

图4

图4。Pinch1/2损失不会加剧手术诱导OA病变老鼠。(一)模式说明实验设计。(B)免疫荧光染色Pinch1的关节软骨。酒吧规模:200μm。(C)代表红色染料O和快速green-stained膝关节部分的图像从它莫西芬-或玉米油Aggrecan^CreERT2;Pinch1^{液氧/液氧};Pinch2^−−/老鼠在DMM手术后8周。高放大图像低面板显示关节软骨、增长板软骨、滑膜和半月板。酒吧规模:200μm(d)定量组织学分析OARSI得分,软骨,滑膜炎得分,并使用膝关节部分骨赘的分数。注意:N = 6为每组小鼠。结果表示为平均值±标准偏差(其中)。ns:不重要。

方法

动物

Pinch1的生成^{液氧/液氧}和Pinch2^−−/老鼠曾描述(Lei et al ., 2020)。获取Aggrecan^CreERT2;Pinch1^{液氧/液氧};Pinch2^−−/老鼠,Pinch1^{液氧/液氧}首先在老鼠与Pinch2交叉^−−/小鼠产生Pinch1^{液氧/ +};Pinch2^{+ /−}老鼠。的Pinch1^{液氧/ +};Pinch2^{+ /−}老鼠然后生成Pinch1相互繁殖^{液氧/液氧};Pinch2^−−/老鼠。与此同时,Pinch1^{液氧/液氧}老鼠与Aggrecan交叉^CreERT2小鼠产生Aggrecan^CreERT2;Pinch1^{液氧/ +}老鼠。的Aggrecan^CreERT2;Pinch1^{液氧/ +}获得Aggrecan老鼠互相交叉^CreERT2;Pinch1^{液氧/液氧}老鼠。最后,Aggrecan^CreERT2;Pinch1^{液氧/液氧}与Pinch1老鼠繁殖^{液氧/液氧};Pinch2^−−/老鼠生成Aggrecan^CreERT2;Pinch1^{液氧/液氧};Pinch2^{+ /−}老鼠。然后Aggrecan^CreERT2;Pinch1^{液氧/液氧};Pinch2^{+ /−}老鼠繁殖相互生成Aggrecan^CreERT2;Pinch1^{液氧/液氧};Pinch2^−−/老鼠。应该注意的是,在Aggrecan全球Pinch2基因灭活^CreERT2;Pinch1^{液氧/液氧};Pinch2^−−/老鼠。Pinch1基因的诱导删除aggrecan-expressing软骨细胞,男性Aggrecan丽江^CreERT2;Pinch1^{液氧/液氧};Pinch2^−−/老鼠管理与三苯氧胺(σT5648, 100毫克/公斤体重/天)通过腹腔内注射如前所述(吴et al ., 2022 a;吴et al ., 2022 b;陈et al ., 2022)。的同龄男性Aggrecan^CreERT2;Pinch1^{液氧/液氧};Pinch2^−−/老鼠管理和玉米油作为对照组。所有研究协议在本研究机构批准的动物保健和使用委员会(IACUC)的南方科技大学。

组织学和immunofluorescent分析

鼠标的组织学分析膝关节进行根据我们先前建立协议(刘et al ., 2021;吴et al ., 2022 a;吴et al ., 2022 b;赖et al ., 2022)。5-μm厚膝关节部分都沾染了红色染料O和快速绿色使用商业套装(Solarbio,猫# G1371)。OA-related参数,包括OARSI得分,滑膜炎分数,用组织学和骨赘的分数量化评分系统(如前所述)(吴et al ., 2022 a)。领域的红色染料O-stained关节软骨被ImageJ测量(版本1.53 k)如前所述(吴et al ., 2022 a)。代表图像的红色染料O和快速绿色染色选择基于组织学得分的平均值。Immunofluorescent(如果)染色进行使用抗体Pinch1 (Abcam ab108609)和Pinch2 (Abcam ab173008)根据我们先前建立协议(王et al ., 2019;高et al ., 2021;瞿et al ., 2022)。

统计分析

在这项研究中使用的所有老鼠被随机分配给每个小组。使用棱镜GraphPad统计分析完成。结果表示为平均值±标准偏差(其中)。双尾未配对的学生的学习任务来比较两组之间的差异。差异与p< 0.05被认为是具有统计学意义。

讨论

软骨形成过程是一个独特的间叶细胞祖细胞浓缩和分化成软骨细胞形成软骨(Goldring 2012)。在开发过程中,软骨是一个瞬态和高度动态的结构,由骨逐渐取代,使骨骼的生长。相比之下,成人关节软骨是一个更加稳定的组织,提供终身的滑膜关节结构和功能完整性(Haseeb et al ., 2021)。我们以前报道,捏蛋白在调节软骨形成和软骨的形成起着至关重要的作用在骨骼发育(Lei et al ., 2020)。压力损失Prx1-positive间叶细胞祖细胞(这种破坏^Cre;Pinch1^{液氧/液氧};Pinch2^−−/)严重损害软骨形成,导致软骨细胞死亡和肢体缩短小鼠。这些发现提示我们测试是否捏蛋白质有一个角色在维持体内平衡的成人软骨和变更是否表达与OA相关联。出人意料地,这项研究的结果表明,删除aggrecan-expressing软骨细胞(Aggrecan压力表达式^CreERT2;Pinch1^{液氧/液氧};Pinch2^−−/)没有对成年小鼠关节软骨结构的影响。除了关节软骨外,其他aggrecan-expressing联合组织,包括生长板软骨和半月板,都Pinch-deficient老鼠和控制老鼠之间的可比性。此外,我们已经测试了压力损失是否会影响软骨结构和OA进展在两种老化,DMM-induced OA小鼠模型。结果显示无显著差异在OA-related组织学参数Pinch-deficient老鼠和控制小鼠自发和surgically-induced OA模型。这些结果,随着从我们先前的研究结果,揭示了不同角色的捏蛋白质在软骨组织发展和成年。

IPP复杂,包括亲属、捏和帕文,英足总复杂(是一个重要的组成部分Stiegler et al ., 2013)。它稳定肌动蛋白细胞骨架之间的连接和胞质尾β整合蛋白,而损失的IPP复杂大大削弱了FA形成(李et al ., 1999;Vakaloglou怀中et al ., 2016)。IPP的组装复杂的稳定是至关重要的,其个别蛋白质的细胞功能组件(Zhang et al ., 2002;Stiegler et al ., 2013)。失去亲属或压力导致另外两个蛋白的降解IPP复杂的组件(福田et al ., 2003;李et al ., 2005)。整合素激活,Kindlin-2直接结合β整合素的尾巴和与之交互的同类的招聘IPP复杂的足总网站(Montanez et al ., 2008;Qadota et al ., 2012)。Kindlin-2损失结果没有亲属或夹在足总复杂(Wickstrom et al ., 2010)。我们以前的研究已经表明Kindlin-2和捏小鼠软骨形成和骨骼发育所需的蛋白质(吴et al ., 2015;Lei et al ., 2020)。最近,我们已经表明,Kindlin-2的表达也是维护软骨内稳态的关键在成年期(吴et al ., 2022 a;赖et al ., 2022)。有趣的是比较小鼠的表型缺乏Kindlin-2成人软骨(Aggrecan^CreERT2;Kindlin-2^{液氧/液氧})在我们先前的研究在成年小鼠缺乏Pinch1/2软骨(Aggrecan^CreERT2;Pinch1^{液氧/液氧};Pinch2^−−/在这项研究中。Kindlin-2损失导致多种严重自发OA-like表型,包括逐步退化的关节软骨、滑膜炎、蛋白质和骨赘的形成,而压力损失原因没有明显的异常。这些结果表明,比捏Kindlin-2扮演更重要角色在aggrecan-expressing软骨细胞蛋白质的维护成人软骨内稳态。

总之,这些结果表明,尽管捏软骨形成和软骨发育所必需的蛋白质,他们的表情似乎不不可或缺的成人软骨。是否其他FA-related蛋白质,如蛋白、Vinculin,软骨和桩蛋白,参与开发和体内平衡在未来的研究需要进一步调查。

数据可用性声明

原始数据支持了本文的结论将由作者提供,没有过度的预订。

道德声明

动物研究是审查和批准的机构动物保健和使用委员会(IACUC)的南方科技大学。

作者的贡献

研究设计:GX XW, SL研究行为和数据收集:SL, XW, RL,噢,QY, XZ,和GX数据分析:GX, XW,和SL数据解释:GX, XW,和SL起草手稿:GX和XW。GX XW, SL负责数据分析的完整性。

资金

这项工作得到了中国国家重点研发项目资助(2019 yfa0906001),中国国家自然科学基金资助(82230081,82250710175,82172375,81991513,81870532),深圳市科技创新委员会授予(ZDSYS20140509142721429)和广东省科技创新委员会授予(2017 b030301018)。

确认

作者承认SUSTech的核心研究机构的援助。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

处理编辑DX公开共享父归属与作者(年代)RL,复习的时候。

审稿人GH宣布与作者(年代)RL分享父母联系,会处理编辑的审查。评论员弗兰克-威廉姆斯宣布共享父归属与作者(年代)SL, XZ处理编辑的审查。

出版商的注意

本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。

引用

陈,K。你,Y。,张,Y。,Blair, H. C., Zhang, L., and Wu, C. (2008). PINCH-1 regulates the ERK-Bim pathway and contributes to apoptosis resistance in cancer cells.生物。化学。283年,2508 - 2517。doi: 10.1074 / jbc.M707307200