迷你评论文章

前面。细胞Dev。杂志。2023年2月24日
秒。癌症细胞生物学
卷11 - 2023 | https://doi.org/10.3389/fcell.2023.1101041

microrna的表达谱计算预测目标PDL-1宫颈组织中不同的组织学组

Danai Leventakou¹ ^__

Alina-Roxani Gouloumi ¹ ^__ www.雷竞技rebatfrontiersin.org

阿里斯Spathis¹

亚伯拉罕Pouliakis ¹*

据称Koufopoulos ¹ www.雷竞技rebatfrontiersin.org

Vassilios Pergialiotis² www.雷竞技rebatfrontiersin.org

彼得Drakakis³ www.雷竞技rebatfrontiersin.org

Ioannis g . Panayiotides¹

克里斯汀Kottaridi ^1、4*

¹2日病理学系大学总医院Attikon医学院的国家和大学Kapodistrian雅典,雅典,希腊
²亚历山德拉总医院妇产科1日,国家和大学Kapodistrian雅典,雅典,希腊
³第三妇产科学系医学院大学总医院Attikon国家和大学Kapodistrian雅典,雅典,希腊
⁴遗传学、发育和分子生物学,生物学院亚里士多德大学塞萨洛尼基,塞萨洛尼基,希腊

背景:人类乳头状瘤病毒(HPV)被认为是一个成功的病原体,因为它有能力逃避宿主免疫反应和建立长期的持续感染。据报道,程序性死亡配体1 (PDL-1)表达与HPV-positivity和增加病变进展或在宫颈癌肿瘤转移。小分子核糖核酸的表达(microrna)通常是放松管制的癌症,及其潜在的目标受到影响。

方法:RNA提取从formalin-fixed石蜡包埋(FFPE)宫颈的样本不同的组织学类型,类型的人乳头状瘤病毒的存在。特定的定量聚合酶链反应(qPCR)协议SYBR绿色被用来检查四个microrna的表达目标PDL-1计算预测。

结果和结论:hsa-miR-20a-5p和hsa - mir - 106 b - 5 - p显示表达式与病变的严重程度增加,而hsa - mir - 125 b - 5 - p描述显著降低其表达癌样本相比正常样本。

1介绍

宫颈癌全世界所有癌症中排名第三的女性。2018年,569847名妇女宫颈癌发展在世界范围内,被记录和311365人死亡。宫颈癌是第二个最常见的女性癌症在15 - 44岁妇女,大部分的全球负担发生在欠发达地区(https://gco.iarc.fr/today2022年4月1日)访问。自1999年以来,人类乳头状瘤病毒(HPV)被认为是宫颈癌的主要原因(Ahmadzadeh et al ., 2009)。到目前为止,已经发现了超过200人乳头状瘤病毒类型,分为皮肤和粘膜基于组织他们感染人类乳头瘤病毒。粘膜人类乳头瘤病毒是临床上分为“高危”和“低风险”基于恶性发展的倾向。人乳头状瘤病毒被认为是一个成功的病原体,因为它有能力逃避宿主免疫反应和建立长期的持续感染。

免疫检查点的抑制性和刺激通路网络支持免疫反应和维持自我耐受性。经常引发癌症免疫检查点机制阻止抗肿瘤免疫反应的发展。程序性细胞死亡蛋白1 (PD-1)是一种55-kDa跨膜蛋白与细胞外的n端结构域含有288个氨基酸,membrane-permeating域和胞质尾(石田et al ., 1992)。其配体(PDL-1)是B7家族的一员,通常是由巨噬细胞表达一些激活T细胞,B细胞,树突状细胞和上皮细胞在炎症条件下(夏普et al ., 2007)。它是由肿瘤细胞也表达了为了避免抗肿瘤免疫反应(Sanmamed和陈,2014)。PD-1 / PDL-1启动自我耐受性下调免疫系统的反应,通过抑制t细胞炎性活动(Sanmamed和陈,2014)。

PDL-1表达式与HPV-positivity和增加病变进展或宫颈癌肿瘤转移(Reddy et al ., 2017;W。杨et al ., 2017)。然而,其他研究(Brismar et al ., 2010;冯et al ., 2018)报告互相矛盾的结果,从而突出的必要性,进一步说明人乳头状瘤病毒的作用的分子机制PDL-1蛋白介导肿瘤逃逸。microrna与重要功能的非编码rna在一些生物过程,如细胞周期的调控,免疫反应,炎症和细胞凋亡。microrna附加到目标的3′UTR信使核糖核酸(mRNA)抑制其翻译。肿瘤抑制或者致癌基因的表达是受microrna的失调,癌症的发病机理有关,许多研究说明这种关系(Gurtner et al ., 2016;Rupaimoole et al ., 2016)。

在这项研究中,计算microrna预测,根据特定的算法在线工具绑定到3’UTR PDL-1 mRNA的选择,及其表达谱formalin-fixed石蜡包埋(FFPE)临床样本不同的组织学分类探讨了。最初的假设是,如果研究microrna能针对PDL-1 mRNA,随后抑制其生产、downregulation研究microrna的高档PDL-1病变可能是其中一个原因是过表达,因此建议可能的潜在的治疗干预的有力候选人。

2材料和方法

组织学部分获得115年FFPE宫颈活检没有怀孕20至81岁的白人女性。组织学诊断包括以下组:正常宫颈上皮内瘤(CIN1, CIN2, CIN3)鳞状细胞癌(SCC)和腺癌。细节的品位和阶段提出了癌症病例表1。

表1

表1。每个癌症分期和成绩的癌症病例类型。所有的病例被报告为转移。

所有研究样品以前存在的基因分型人乳头状瘤病毒使用商用实时PCR分析工具包(HPV基因型14 Real-TM量化,Sacace生物技术,科莫,意大利)与QIAamp DNA DNA提取后FFPE组织工具包(试剂盒GmbH)后,制造商的指示。从formalin-fixed microrna的净化和总RNA,石蜡包埋组织进行使用miRNeasy FFPE工具包(试剂盒GmbH)。RNA的数量和质量进行评估使用QIAxpert(试剂盒GmbH)。反转录与miScript II执行RT工具包(试剂盒GmbH),每逆转录反应,RNA浓度调整到500 ng,根据设备制造商的建议。互补脱氧核糖核酸准备适当稀释,根据提供的协议miScript II RT工具包(试剂盒GmbH)和10 - ng cDNA被用于研究microrna的量化和PDL-1 mRNA。实时PCR定量的microrna的成熟,有针对性的miScript底漆化验(正向引物)和miScript SYBR绿色PCR工具包,它包含miScript通用引物(反向引物)和QuantiTect SYBR绿色PCR反应混合液(试剂盒GmbH)。为PDL-1基因表达分析,QuantiTect底漆试验(猫。PPH21094A数量,试剂盒GmbH)用于实时PCR扩增SYBR绿色。循环反应都是在重复执行试剂盒Rotor-Gene Q (Corbett Rotor-Gene 6000)实时PCR循环。

研究小组的microrna的选择是基于下面的在线工具的搜索:1)戴安娜的工具,2)miRDB, 3) TargetScanHuman (9 - 12)。这些计算microrna的目标寻找他们所使用的算法和由不同分析成千上万的miRNA-target交互。用户可能提供microrna的名称和搜索目标和预测的基因反之亦然。hsa - mir - 106 b - 5 - p, hsa - mir - 200 - a - 3 - p, hsa - mir - 125 b - 5 - p,和提出了hsa-miR-20a-5p microrna目标PDL-1 mRNA最好的累积分数。

正常化使用几何平均的microrna进行良性的样品,和相对表达式计算通过使用2^-ΔΔCt方法。规范化的稳定性验证了使用geNorm宏,当使用miR-23a显示最低的变异和mir - 191 - 5 - p。这两个microrna是选择结果的基础上沈et al . (2011),这两种microrna基因的组合作为最优参考microrna可以用作microrna的标准化者RT-qPCR检测在临床宫颈组织。在SPSS统计分析进行了25为Windows和SAS 9.4 Windows使用非参数测试,由于正常并非保证(使用Shapiro-Wilk测试)。具体来说,我们应用Mann-WhitneyU以及比较两组或的克鲁斯卡尔-沃利斯检验比较两个以上的组织团体。识别任何潜在的女性的年龄和microrna的水平之间的关系进行使用斯皮尔曼相关系数(r_年代)。将统计显著性水平p< . 05,所有测试都是两面的。

PDL-1 mRNA表达进行了分析以类似的方式,ACTB(肌动蛋白β)被用于规范化。

3结果与讨论

临床样本和负组织学(n= 15)HPV-negative,所有剩余的(n= 100)至少有一个高危人乳头状瘤病毒类型。高度致癌HPV类型16或18 64%的患有乳腺癌样本中发现(详细结果HPV亚型识别每个组织学分类随着多重感染的病例数,高风险(人力资源)感染和低风险(LR)感染了表2)。为了找到一个可能的相关性microrna的放松管制和高度致癌类型HPV16或HPV18感染,microrna的表达分析,没有发现显著差异(数据没有显示)。

表2

表2。组织学检查的结果研究人口和人乳头瘤病毒基因分型的结果。HPV亚型以粗体显示高危亚型。人力资源、高风险(女性);LR、低风险(女性)的数量。

PDL-1 mRNA表达调节病变进展。具体来说,中位数和CIN1 Q1-Q3范围的表达水平,CIN2 +,和癌症病例。45(22 - 2.44),1.19(票价- 1.85),和2.74(2 - 25.57),分别为(p= .0481)。主要两个microrna描述统计上显著的超表达与病变进展。癌症和CIN1之间hsa-miR-20a-5p,超表达(p= .018)和癌症之间CIN2 + (p= .003)是描述。hsa - mir - 106 b - 5 - p在所有病变与正常样本相比显著增加(p= .009,p= .002,p=措施),而没有显著改变hsa - mir - 200 - a - 3 - p表达式被确认不同组织学类型(p= .2081)。表达谱的比较hsa - mir - 125 b - 5 - p之间正常,CIN1, CIN2 +样品略有减少(p= .029,p= .0081,p分别为= .0004),同时朝着高档差别表明对这些病变(图1)。在这项研究中,结合hsa-miR-23a-3p和hsa - mir - 191 - 5 - p作为最优参考microrna可以用作microrna的RT-qPCR标准化者(实时定量PCR)检测在宫颈癌组织之前发表(沈et al ., 2011)。

图1

图1。盒子,须块规范化microrna的水平与组织学诊断。框限制对应象限1和四分位数3值,盒内的行对应值,中位数和菱形符号对应的平均值。须限制对应最小和最大异常排除后观察。圆圈对应于实际测量。然而,极端的测量没有出现由于垂直轴的规模。p值相邻盒子角落克鲁斯卡尔-沃利斯检验的结果,和对组织团体之间的显著差异(通过的Mann-WhitneyU以及)提出了通过水平线和有关p值。

相对于年龄,正如预期的那样,一个显著差异(p<。)与消极的组织学观察女性(年龄中位数:46;Q1-Q3: 37-53年),CIN1(中值:31.5;Q1-Q3: 26-40), CIN2和CIN3总和(中位数:31;Q1-Q3: 27-43年)和癌症(中位数:47;Q1-Q3: 42 - 59.5年)。此外,年龄和microrna的表达的相关系数如下:r_年代=−。02 (p= .820)对hsa - mir - 106 b - 5 - p, r_年代=−。21日(p= .027)对hsa - mir - 200 - a - 3 - p, r_年代=−。08年(p= .384)对hsa - mir - 125 b - 5 - p, r_年代=酒精含量(phsa-miR-20a-5p = .122)。值得注意的是,发现了一个显著负相关之间的年龄和hsa - mir - 106 b - 5 - p。然而,由于这是一个弱相关性(r_年代=−.21),它可能不是归因于一些生物效应。

有,而有限的数据来确定疾病阶段和年级的microrna的表达的作用,因此,我们的分析不能证明任何显著差异的研究microrna。然而,对于hsa - mir - 200 - a - 3 - p,有一个高值的趋势在T2情况下比T1(中值:1.64,Q1-Q3:大于- 47.06 vs 54, Q1-Q3:。31 -。92年,分别p= .0726)。与肿瘤分级(与1级4例,18例二年级,三年级和六例),它无法确认任何显著差异的microrna。

自从microrna可以针对多个mrna, miR-based基因治疗可以抑制一个吸引人的方法新创癌基因蛋白的表达,比如PDL-1。因此,我们进行了一次bioinformatics-based搜索microrna PDL-1可能目标的目的在网上的microrna的建议可以作为负调节抑制PDL-1,导致信使rna降解或翻译镇压。

根据我们的结果,高浓度的PDL-1信使rna是记录在鳞状细胞癌和腺癌。在研究中通过Rischin et al。(2020),PDL-1 mRNA表达水平分析了基于数据产生的癌症基因组图谱(TCGA)研究网络(https://www.cancer.gov/tcga),PDL-1 mRNA表达被发现更大的扁平比non-squamous宫颈癌样本。在我们的研究中,没有发现这样的差别很可能由于小尺寸的鳞状或non-squamous宫颈癌样本。

mir - 106 b - 5 - p中扮演一个重要的角色在致癌作用充当oncomiR或肿瘤抑制通过调节几乎所有癌症细胞生物过程,包括细胞周期、增殖、凋亡、分化、侵袭、血管生成、耐药性和转移(C。杨et al ., 2020)。在宫颈癌,mir - 106 b的一个重要upregulation - 5 - p已经确认,并提出了这upregulation调节基因的表达,在PI3K-Akt信号起到至关重要的作用,粘着斑和癌症(易et al ., 2018)。先前的研究表明,hsa-miR-20a-5p宫颈癌组织中的表达显著调节。其超表达可能促进肿瘤发生和功能作为一个潜在的诊断和预后的生物标志物在宫颈癌疾病(周et al ., 2019)。根据龚et al。(2022)hsa-miR-20a-5p绑定的bioinformatical预测,3′未翻译区PDL-1功能验证,相关的upregulation PDL-1。苏et al。(2020)探索的生物功能hsa - mir - 200 - a - 3 - p与宫颈癌,后抑制hsa - mir - 200 a - 3 - p在海拉细胞,他们得出的结论是,这个microrna促进宫颈癌细胞增殖和激活HIF-1α/ VEGF(低氧诱导因子1α/血管内皮生长因子)针对信号通路EGLN1基因(egl-9家庭低氧诱导因子1)。据文献,有越来越多的证据的影响验证hsa - mir - 125 b - 5 - p对癌症的发展是极其复杂的,与hsa - mir - 125 b - 5 - p作为癌基因和肿瘤抑制胃癌细胞,膀胱癌,神经胶质瘤肝癌和结直肠癌(梅洛et al ., 2021;Jesionek-Kupnicka et al ., 2019;l太阳et al ., 2021;田中et al ., 2017;温家宝et al ., 2022)。在宫颈癌组织中,hsa - mir - 125 b - 5 - p的表达显著调节,这超表达显著下降有关HMGA1基因(高机动组AT-hook 1)表达,无进展生存,总体生存和预后(B。太阳et al ., 2019)。魏et al。(2019)显示与HMGA1 PDL-1直接相互影响,进一步激活PI3K-Akt和mek erk通路在结肠直肠癌。具体来说,upregulation PDL-1增加HMGA1的表达水平,这一发现可能值得调查宫颈癌。

在目前的研究中,我们的工作是评估是否microrna计算预测目标PDL-1有一个表达谱,解释了这些microrna与目标之间的相关性。最初的假设是,如果一个microrna在检查组织样本,差别显示对这些协议的可能差别观察对这些目标超表达作为一个潜在的生物机制的一部分。不可否认的是,一个功能性研究提供坚实的证据之间的真正关系评估microrna PDL-1。然而,我们旨在初步检查队列样品和建议可能的相关性。

这样的证据可能的相关性研究microrna的表达下降中高档病变,如PDL-1调节在宫颈癌。显然,尽管通过生物信息学工具,hsa-miR-20a-5p和hsa - mir - 106 b - 5 - p建议尽可能PDL-1 mRNA的目标。这些microrna的发现我们的研究提出,不应认为是这样,而是oncomiRs,因为这是他们过度中高档病变。虽然这个发现并不是按照我们的预期假设,这是一个重要的观察记录microrna的改变可能为抗癌药物开发提供一个有吸引力的目标。

microrna在目前的队列研究中,略微减少hsa - mir - 125 b - 5 - p表达谱是描述,从而证明可能这个计算预测microrna与目标之间的相关性,这可能是一部分的分子途径增加PDL-1表达式。这种不平衡的表现无疑是另一个重要的观察,需要进一步澄清了在一个更大的群体,这里描述的趋势可以证实。功能研究调查是否PDL-1构成的可能目标hsa - mir - 125 b - 5 - p是非常必要的,目前正在进行的研究的对象在我们的实验室。

最近的研究揭示了一个强大的microrna与不同癌症类型的发生之间的相关性。这个简短的沟通,我们努力澄清一个可能的microrna与PDL-1之间的相关性,打算增加迅速获得利益等分子的使用替代工具在宫颈癌治疗策略。

作者的贡献

概念化:CK和;方法:DL和A-RG;验证:美联社;原创作品草稿准备:DL和A-RG;writing-review和编辑:副总裁、PD和IP;监督:CK和IP。所有作者已阅读及同意发布版本的手稿。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

出版商的注意

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引用

Ahmadzadeh, M。约翰逊,l。,Heemskerk B。Wunderlich, j . R。达德利,m E。,白色,d, E。,et al。(2009)。肿瘤抗原CD8 T细胞浸润肿瘤表达高水平的PD-1功能受损。血114 (8),1537 - 1544。doi: 10.1182 /血液- 2008 - 12 - 195792