动力学分析synaptonemal复杂的动力学在减数分裂的酵母酿酒酵母揭示两相的增长和流产的拆卸

介绍

减数分裂是一个至关重要的部分在配子形成有性生殖的生物。减数分裂项目的独特之处在于,发现和纵向对齐同源染色体复制伙伴交换遗传物质,然后隔离两次,导致单倍体配子。同源染色体两两对齐的确保基因同源染色体之间发生交换。跨界车,或互惠的基因交流,导致染色体配对服务之间的物理连接来调整适当的隔离。synaptonemal复杂(SC)矩阵形式的蛋白质同源染色体的长度和被认为是稳定同源染色体配对和规范的复合事件发生在染色体的长度(湖和哈雷,2021)。SC由横向元素,形成沿每个复制相同器官,中部地区的有序蛋白质团结这些轴。SC的中部地区,但不是轴,似乎在酵母和蠕虫的属性(罗格et al ., 2017),weakly-bonded蛋白质结构中可以移动。SC的装配是一个动态的过程,似乎是由于染色体末端的拉细胞核以外使用连接的核膜的染色体通过林肯复杂,微管和肌动蛋白纤维拉(艾利瓦Smolikove, 2017)。拆卸的SC协调解决染色体之间的联系,和它的时机是受细胞周期调控Hochwagen亚,2006年;约旦et al ., 2009)。因为在减数分裂的失败可以导致不孕,流产和潜在的后代发育问题,重要的是更好地了解SC装配和拆卸。此外,SC的形成是一个巨大的分子自组装的壮举,其机制可能为其他大型装配过程经验教训的细胞。

有三个标识中部地区在酵母蛋白质。Zip1, SC中部地区的重要组成部分,是一种structurally-conserved蛋白在酵母(首次发现信谊et al ., 1993)。Zip1和功能类似的蛋白质在老鼠、蠕虫、植物和哺乳动物包括长卷曲螺旋灯丝与非结构化域两端(页面和Hawley, 2004年)。这些横向丝,通过交互的卷曲螺旋中部地区被认为形成氨基四聚物的构建块,自组装成的SC c端区域与横向交互元素(盾和罗德,2000;傻瓜et al ., 2018)。这个配置和螺旋线圈的长度是负责保存100海里SC的宽度(信谊和罗德,1995)。GFP-tags插入中间Zip1及其同系物(白色et al ., 2004)已被广泛用于可视化在减数分裂染色体动力学,包括快速telomere-led运动(Koszul et al ., 2008)和SC流动性(罗格et al ., 2017)。中部地区所确定的其他两个蛋白质Ecm11和Gmc2 Zip1促进大会(汉弗里et al ., 2013)。Gcm2促进sumoylation Ecm11的E3相扑连接,Siz1和Siz2 (梁et al ., 2015)。Zip1, n端,激活进一步sumoylation Ecm11这积极的反馈循环形成了SC (梁et al ., 2015)。Voelkel-Meiman et al。(2012)使用额外的副本ZIP1表现出积极的浓度之间的相关性Zip1和突触发生的速度。

SC形成的起始似乎发生在两个位置:1)假定交叉站点和/或2)特定的染色体领域。在出芽酵母基因交换的网站积累蛋白质吸引对SC启动组件重要(蔡美儿和罗德,1998;阿加沃罗德,2000;Tsubouchi et al ., 2006;Pyatnitskaya et al ., 2022)。的一个子集,这些网站可能是负责大部分SC提升。酵母着丝粒也是SC起始的网站中,着丝粒似乎最早地区积累SC蛋白质和启动SC形成(Tsubouchi et al ., 2008)。SC开始在着丝粒许可后才重组已经开始(Macqueen罗德,2009)。在生物体不依赖重组进行同源染色体,特殊染色体网站用于对和发起突触。在线虫秀丽隐杆线虫,每个染色体配对中心存在一端,负责装配SC同系物。在这种情况下,SC形成独立于重组(Dernburg et al ., 1998)。在飞,d .腹SC启动发生在着丝粒,也独立于重组(Takeo et al ., 2011;Tanneti et al ., 2011)。

在线虫卵母细胞,染色体年底启动SC形成染色体配对中心所在,并迅速和不可逆转地完成SC (罗格和Dernburg, 2015)。SC组装的速度是150 nm /分钟。线虫的六个染色体发起独立突触和随机,完成在5小时内突触核通过过渡区。染色体的运动动力蛋白援助SC的扩展,因为太阳突变体,减少dynein-directed染色体运动导致严重减少的速度组装(34海里/分钟)。自秀丽隐杆线虫是迄今为止唯一生物SC动力学测量,问题仍然在于,SC动力学显示类似的行为在酵母和人类等生物,这依赖于突触发生重组。

在出芽酵母,很难想象SC动力学由于大量的染色体在一个小核;有16对染色体2.0∼μm直径细胞核。裂殖酵母只有三染色体,但裂殖酵母不形式SC (巴尔et al ., 1993)。然而,突触染色体数量减少zip3Δ突变体在出芽酵母可以让SC动力学的跟踪。zip2是E3泛素连接酶的直接同源被发现在许多不同的生物(阿加沃罗德,2000;Jantsch et al ., 2004;Chelysheva et al ., 2012)。而突变体的zip2基因在大多数生物体似乎影响交叉形成,酵母突变体另外展览减少突触启动(阿加沃罗德,2000)。当zip2被删除,SC启动主要发生在染色体着丝粒和更少的形式SC (Macqueen罗德,2009)。

这里,我们利用突触数量减少染色体和起始位点zip3Δ突变体允许的测量的实时动力学SC个体染色体上的装配和拆卸酵母。我们发现在出芽酵母SC大会发生由单调增加长度,类似于观察秀丽隐杆线虫酵母,但是组装的速度是平均的一半速度观测到的线虫。我们表明,单相和两相的增长率都观察到,在线虫与动力学。两相的增长由最初的快速随后较慢的速度来完成组装。最后的拆卸展品单相的拆卸。最后,我们发现这一过程术语“流产SC拆卸”,这是不同于最后的SC拆卸,SCs解聚的细胞之前就完成了SC组装阶段。我们建议流产SC拆卸可能代表缺陷/非生产性或异源SCs的解散。我们认为这是一个机制,细胞可能会使用正确的突触或染色体之间的相互作用是巩固了之前解决联锁。

材料和方法

减数分裂的时间进程和SCs的检测

菌株,减数分裂是由第一次种植细胞2毫升YPD补充与1.0毫米腺嘌呤和孵化辊筒在30°C完全24 h,然后由离心分离细胞和转移至10毫升的2%乙酸钾在125毫升玻璃瓶30°C平台瓶在230 rpm。细胞在定义的时间点,然后收获,准备住显微镜通过集中收获细胞孢子形成媒体然后离心法到伴刀豆球蛋白经处理的菜环境室(Bioptechs Inc . # 04200415 c,巴特勒,PA)的好硅胶垫片(恩典Bio-Labs 50 # cwc r - 1.0,弯曲,或)。细胞Bioptechs盘被安装在一个OMX显微镜(多臂机et al ., 2011)在30°C和查看使用加热的目的(1.45×100奥林巴斯NA油浸在30°)。活细胞成像可以找到的细节波拉德和冯(2017)。

Zip1-GFP和突触染色体被发现在一个50 nm窗口集中在使用激励频率488 525海里。激发激光衰减到3.5%或0.86%,个人接触5 ms。图片是在4到10µm z-stacks 0.2µm间隔部分。收购后的成像处理核参与连接的点,去噪(面包师et al ., 2010),反褶积。图像检测和操作,以及Zip1-GFP信号的定量测量synaptonemal复杂的长度,进行使用PRIISM软件(陈et al ., 1992)。自动化SC进行追踪和动态测量用脚本编写MATLAB (Mathworks,纳蒂克MA),虽然手动跟踪SCs也在PRIISM执行。2 d预测要么是覆盖最大和求和(max-sum)预测在Z(显微镜)的轴向尺寸或三重覆盖,是一个额外的覆盖由一个倒置的背景和扩展不同为了显示核边界定义分散Zip1-GFP蓝色。

染色体的利差,鱼和疣状

染色体利差进行如前所述(Fung et al ., 2004)。荧光原位杂交(鱼)进行了使用两个相邻interval-specific DNA探针。为LEU2-MAT间隔,质粒12 b (Newlon et al ., 1991包含20 kb)染色体III的区域扩展∼5 kb centromere-distal∼15 kb centromere-proximal的RPS14A基因被用于制造探测器。为HIS4-LEU2间隔15 kb地区开始HIS4中间和结束KCC4在2 kb片段扩增从菌进行基因组DNA。探针标记了biotin-14-dATP(英杰公司# 19524016,沃尔瑟姆,MA)或digoxygenin-11-dUTP(罗氏# 11093088910,巴塞尔,CH)和杂交中描述执行Dernburg和塞达特(Dernburg塞达特,1998)。幻灯片是沾anti-rabbit Zip1抗体,然后与二次抗体:罗丹明anti-DIG和FITC-streptavidin Cy5 anti-rabbit抗体。DNA染色,1μg /毫升DAPI p-phenylenediamine添加到山由0.1%(西格玛奥德里奇# P6001,伯灵顿,MA)甘油。Zip1多克隆抗体是慷慨地提供9罗德(耶鲁大学)。

孢子形成频率

指数期文化YPAD被转移到10毫升的2%乙酸钾然后摇动烧瓶在30°为5天。细胞样本然后准备幻灯片和3 d可视化具有亮OMX显微镜显微镜。孢子的数量在每个单元内亮视场图像成交量列表。

孢子的生存能力

二倍体修补,2%乙酸钾盘子和增长30°C 3天。四联球菌被切割到YPD盘子。可行的孢子的频率确定后3天的增长30°C。

模型拟合,调整r平方并按统计数据

分段回归和媒体统计计算组装,最后拆卸,拆卸流产率进行使用r .代码是改编自https://gist.github.com/tomhopper/8c204d978c4a0cbcb8c0和https://cran.r-project.org/web/packages/segmented/segmented.pdf。

期望频率的计算多个启动

基于泊松分布,我们可以计算的概率看到k数量的提升,平均数量的事件,λ。

看到的频率 $\ge$ 2提升 $f$ ( $\ge$ 2)= 1−ƒ(0)−ƒ(1)。使用二项测试计算器,没有看到的概率 $\ge$ 2 n后开始观测可以使用n计算; $f$ ( $\ge$ 2)。

结果

在活的有机体内可视化的单染色体联会zip3Δ在减数分裂

可视化在酵母染色体联会染色体,我们进行三维(3 d)延时的研究突触蛋白GFP (Zip1-GFP Zip1融合^700年)meiosis-proficient二倍体酵母菌株(BR 1919 - 8 b)(见材料与方法)。我们构建了一个zip3Δ突变在这个背景评估SC个体染色体更容易组装和拆卸动力学(图1)。在zip3Δ,最大的突触数量染色体获得不同从0到16条染色体(阿加沃罗德,2000;MacQueen罗德,2009)(图1 a, B)。这方面的zip3Δ突变株允许我们监视突触动力学在原子核只包含一个或两个突触染色体(图1 c)。此外,使用zip3Δ变异减少解释突触的并发症通常会沿着染色体在多个站点,因为∼85%的着丝粒染色体联会发起只(Macqueen罗德,2009)。尽管突触的减少程度zip3Δ实现高水平的配对,用一对相邻的鱼在染色体三世在粗线期染色体位点息差(图1 d)。这些结果同意之前研究centromere-associated lacO配对zip3Δ(Voelkel-Meiman et al ., 2019)。通过同时测量配对(协会鱼位点)和突触(Zip1免疫荧光染色体),我们发现与突触相关的双位点只有17.5%的时间zip3Δ相比WT (80%) (图1 d)。在一起,这些结果表明,高水平的配对并不确保高水平的突触,反之,高水平的配对的染色体联会是不必要的。这种能力使没有后续突触可能导致了相对较高的孢子的生存能力zip3Δ变异(50% - -58%,((Macqueen罗德,2009),图1 e)。

见图1,zip3Δ突变通常形成一个polycomplex在粗线期(图1 d,最后一个面板中,白色箭头)。BR背景,polycomplexes synapsis-associated蛋白质的聚集形式SC蛋白质的化学计量学中断时,在不同的情况下减数分裂减数分裂的突变或改变表达蛋白(信谊和罗德,1995;蔡美儿和罗德,1998)。其他生物和其他酵母菌株如SK1可能形成polycomplexes野生型减数分裂的背景下,作为SC形成或SCs溶解(休斯和哈雷,2020)。SC的形成难以定量可视化的两个副本ZIP1-GFP^700年等位基因位于一个zip3Δ背景,因为polycomplex比突触亮大约五倍染色体。通过加入一个副本ZIP1-GFP^700年成一个zip3Δ二倍体的内生的副本ZIP1删除,polycomplex形成的频率减少到只有2.2%的核相比,100%在两个副本的ZIP1-GFP^700年是礼物。在BR背景,只有一个小孢子的生存能力差是当使用半合ZIP1-GFP^700年(85%)半合ZIP1(96%)。孢子可行性之间观察到的病例中没有区别zip3Δ菌株包含ZIP1等位基因(图1 e),建议更换ZIP1与ZIP1-GFP和减少的拷贝数ZIP1-GFP只有一个小对减数分裂的影响。与这些应变修改到位,动能的测量个人SCs是可行的。

正常在粗线期染色体运动在展出zip3Δ突变体

减数分裂染色体进行快速、大规模的运动功能是重要的实现正确的和及时的同源对齐(康拉德et al ., 2008;Koszul et al ., 2008;纳瓦罗et al ., 2022)。在秀丽隐杆线虫这个运动的干扰,太阳突变导致摄动配对和突触伸长(佐藤et al ., 2009;罗格和Dernburg, 2015)。因此,重要的是要确定染色体的行为zip2∆酵母细胞与染色体的运动中观察到野生型。Koszul et al。(2008)特征的运动完全Zip1-GFP permeabilized细胞和突触染色体明显在活的有机体内粗线期的细胞核。他们观察到的运动染色体在减数分裂的粗线期阶段由附件的染色体近端肌动蛋白电缆核膜。这些telomere-led运动表现出速度的0.3 - -0.5μm / s(0.8μm / s),特点是突然转换的速度增加。我们观察到类似的运动zip3Δ(图2一个、电影补充数据S1-S3),0.2 - -0.6μm / s的平均运动范围和更高的转换1.0μm / s (图2 b)。我们的测量zip3Δ也同意结果报道在野生型细胞(康拉德et al ., 2008),他检查了前期快速运动的成像lacO标记的染色体区域。野生型在粗线期染色体行为核的另一大特点,也观察到zip3Δ细胞,染色体是“特立独行”的存在(白色et al ., 2004)。偶尔,特立独行的染色体观察到凸出在很远的地方从大量的染色体,染色体常常与染色体的端到端连接在这像香肠在一个字符串。图2一个强调时间进程的一个例子投影显示这两种类型的行为,telomere-led运动和特立独行的染色体zip2∆突变体在一个核。总的来说,前期染色体运动zip2∆似乎与此前在野生型。

优化的条件在活的有机体内显微镜

它是必不可少的在活的有机体内显微镜研究证明成像条件不扰乱感兴趣的事件和随后的细胞进程(卡尔顿et al ., 2010)。我们协议确保细胞可以完成减数分裂不具有光毒性的效应(补充图S4)。文档成像条件是否允许完成减数分裂,细胞连续成像来确定他们是否形成孢子(图3一)。我们使用荧光显微镜采集三维光学部分(图1 b)的野生型Zip1-GFP菌株从8 h后通过早期减数分裂感应偶线期(∼12到16小时)染色体联会发起时,通过粗线(∼16 h),当染色体联会完成然后在更大的时间间隔152 h进一步确定减数分裂进程(图3 b)。孢子形成被brightfield显微镜监控在不同时期在整个时间进程(图3 b,粉红色的垂直列)。为zip2平均应变77.8%±0.6 SD (n= 179,5实验)的细胞进入减数分裂,基于细胞的数量表达Zip1-GFP。整个孢子形成频率(69%)观察到我们的成像条件下相当于正常孢子形成条件下孢子形成频率测量在文化(69%)(图3 c)。因此,形成孢子的能力是不影响成像条件,表明photodamage是最小的。

减少Zip1表达式和延迟突触动力学zip3Δ突变体

Zip1表达监测在前期确定Zip1表达和SC大会之间的关系。测量Zip1表达式通过荧光强度(FI),三维光学部分的Zip1-GFP形成孢子菌株是每隔1小时50 h(材料和方法)。我们测量的总核FI Zip1-GFP和每个核的体积来评估Zip1-GFP在每个时间点的数量。概要文件的总核Zip1 Fl几个单个细胞的前期我所示zip2和zip3Δ(图4一)。我们观察一个大变化的持续时间Zip1都存在zip2和zip3Δ在单个细胞。

为了比较Zip1概要文件在野生型和zip3Δ细胞在不同的时间开始积累Zip1-GFP (图4一),我们一致的每个配置文件通过设置时间为零当Zip1-GFP第一耗尽zip2和zip3Δ。的数量和平均总Zip1-GFP FI SCs的课程然后计算这两个平均资料互相对齐在染色体联会发起的点(图4 b箭头)。我们发现Zip1表达最初增加第一SC出现之前,继续上升zip2和zip3Δ。Zip1水平下降在粗线期结束之前,Zip1表达式高原zip2平均为1.5 h,而这个时期持续∼4倍的时间(6.3小时)zip3Δ(图4 b)。我们还观察到不同Zip1强度达到最大zip2傅(740±66 SE)相比zip3Δ傅(424±29 SE),只有达到57%的野生型的水平。突然退化Zip1粗线期结束时发生在1小时内zip2野生型细胞,观察到的要快得多zip3Δ突变体,平均发生∼3 h。总的来说,这导致平均6小时时间更多的突触zip3Δ(h) 17日比zip2(11 h) (图4 b)。

SC形成后发生相当于Zip1水平

我们首先观察到SCs出现当平均总Zip1 FI达到大约380×10⁵FI为野生型和类似于310×10⁵FI为zip2∆(图4 b、黑色箭头)。这表明,突触启动可能需要Zip1浓度阈值水平。然而,我们无法区分这一点无论是阈值浓度Zip1或减数分裂阶段进展是SC起始的宽容。像Zip1生产、SCs的堆积速率更快的野生型(1.7±0.5 SD突触染色体/小时)比zip2∆(0.6±0.4 SD突触染色体/小时)突触染色体/ hr)在此期间(图4 c)。野生型,最大数量的SCs无法准确计算但决心要大于10。一项研究使用固定核利差显示平均五个突触染色体zip2∆16在野生型(相比MacQueen罗德,2009)。从图4 b似乎在1 - 3 SCs SCs峰的数量zip2∆。这种差异可能是由于无法准确计算核与10到16 SCs在完整细胞染色体相比传播以及用于确定的细胞核数量平均水平要低图4一。

SC组装不断与单相或两相的动力学zip3Δ

在zip2∆,可以观察和测量个人SCs从开始组装,通过伸长,完成染色体联会(图5)。定量的突触延伸率大大促进细胞在没有其他的跟踪突触染色体。在活酵母,染色体范围从低于0.5µm超过3µm长度。获得足够的测量伸长期间,我们的分析集中在原子核中只有一个长染色体突触(∼0.14%的观察到核)。细胞成像之间的间隔从3到10分钟每个三维堆栈(如图所示的二维投影图5一个与大多数例子每隔3分钟)。确定观察到的SC伸长是连续的,不连续的和/或步进式组装,我们绘制突触地区随着时间的长度(图5 b)。分段回归是用来确定SC组装发生在单个或多个率(图5 c)。预计平方计算,旨在预测残差平方和(媒体)统计区分最小化的最佳模型过度拟合(阿尔坎塔拉et al ., 2022)。对数适合也执行,但平均R²R相比²从分段回归获得更糟糕(0.84和0.98)。

在34个SC测量装配事件,65%的装配是单相,其余(35%)显示两相的组装。在所有情况下,SC组装单调增加,观察步骤之间没有出现长时间的停顿。平均装配率为67 nm /分钟(从12到165海里/分钟,图5 d),这是大约一半的速度对SC组装秀丽隐杆线虫。单相平均增长(56±23 SD nm /分钟)显著低于观察第一和更快的一部分,两相的增长(88±42 SD nm /分钟)。两相的SC增长,SC大会的第二阶段图5 d慢,蓝线)(19±12海里/分钟P_t测试比第一阶段= 0.002)。两相的增长,增长率的贡献平均59%±16% (SD)最终SC的长度。SC长度为每个装配事件中可以找到补充表S2和图5 e。

zip3Δ从一个起始染色体突触

在zip2突变体,有更少的起始事件,其中85%的SC提升来自于着丝粒(Macqueen罗德,2009)。在野生型中,突触开始更频繁地发生在着丝粒但recombination-associated地点,和多个起点是对每个染色体观察(Tsubouchi et al ., 2008)。因为我们没有观察到多个提升230 SC大会事件监控,我们想要评估是否可以归因于一个足够数量的观察。基于泊松统计和SCs的平均数量zip3Δ看到的可能性,我们可以计算多个起点相同的染色体(见材料与方法)。鉴于有五个SCs平均zip3Δ,我们希望看到两个或两个以上的起始位点发生在同一个染色体∼4%的时间。230 SC组装事件,我们观察到,我们没有看到多个成核事件的实例将被延伸SC延伸的融合(图5 f,下半部分)。自二项式方程预测有0.01%的机会错过230 SC总成观察到这样一个事件,这表明Zip1启动只从一个成核网站zip3Δ。

模型对两相的增长潜力

最长的SCs我们测量∼3µm长,有可能对应于完整染色体IV SCs以来第二最长染色体,染色体十五估计2.3∼µm,因此不会被误认为是染色体IV。事实上,只有一个起始位点用于突触zip2∆意味着使用相同的起始位点两次:相反的方向完成染色体联会染色体。因此,我们认为,突触是双向的,尽管这两个提升可能不同步。一个模型来解释两相的增长可能歪着丝粒的结果(即。,neither acrocentric nor metacentric) as in chromosome IV that initiates synapsis from the same site bidirectionally without much delay between initiations (图5 f上面板)。在这个场景中,我们希望为两相的SC大会,第二阶段的增长将发生在SC的一端的染色体,这样就只有另一端与第二阶段增长率持续增长50%的初始速率(图5 f上面板)。相反,第二阶段初始速率的增长率是25%,显著低于预期(P_t.test= 0.002)。另一个可能性是核Zip1浓度影响SC延伸率的结果,细胞的额外副本ZIP1突触前(Voelkel-Meiman et al ., 2012)。测试是否改变Zip1水平影响延伸率,我们问是否Zip-GFP总FI与SC延伸率时的第一SC (图5克)。相关系数r=−0.2观察显示的起始浓度之间没有相关性Zip1和SC伸长速率。这表明不同核浓度的Zip1可能不是决定观察到的两相的利率。

最后拆卸SCs是伴随着Zip1退化

最后SC拆卸伴随着Zip1水平迅速降低,这样大多数Zip1 1小时内删除zip2(图4 b)和∼3 hzip2∆。在退出粗线,Zip1从染色体与未成年人数量的剩余Zip1蛋白质在着丝粒(约旦et al ., 2009;纽汉姆et al ., 2010)。单一长染色体的拆卸zip2∆评估是在我们以前的SC装配测量吗。最后SC拆卸发生通过缩短的SC结束(图6)。我们还探讨了SCs的可能性也拆除了在特定的焦点,类似于焦点用于启动。然而,我们没有看到的外表内的差距缩短SCs,表明在特定的内部网站,SC被拆除。

评估的拆卸,我们策划执行的SC长度作为时间的函数和分段回归确定拆卸单相或发生在多个阶段(图6 b)。在所有情况下,最终的拆卸是单相平均速率−66±30 nm /分钟(SD),类似大小的初始速率观察SC伸长。可能分解率实际上是低于结束,因为如果拆卸同时发生出现两端会分解速率的一半总长度缩短。在许多情况下,有一个初始阶段,发生在一个非常低的速率SCs是退化(5 nm /分钟±5 SD)。因为这个率非常低,我们没有包括这一时期作为一个独立的相位测量误差。这个程序失去Zip1漂白工件(区分开来图6 c)。图6 d显示了SC长度的分布作为时间的函数的利率计算。

流产拆卸发生在SC积累阶段

而获得SC拆卸的例子,许多细胞被发现失踪的SC的没有立即紧随其后Zip1退化。实际上,在很多情况下,其他SCs持续下去,和额外的SCs继续形式如图所示图7。而绝大多数的例子了zip2∆菌株,罕见的例子被发现zip2(图7 b)。这些细胞没有发展的前期,由于Zip1水平仍然居高不下和新生的SCs经常积累。我们有这种类型的SC拆卸“流产SC拆卸。“与最后拆卸Zip1水平降低50%在一个半小时(图4 b在流产),拆卸,Zip1水平居高不下后没有看到(SCs图7 c)。在5小时内,大约30%的核显示流产拆卸的实例(n= 191)。

最终流产拆卸的另一个区别在于SCs的大小分布所涉及两个过程(图7 c)。酵母染色体范围广泛的大小从0.5∼µm∼3µm约25%小(< 0.5微米,活细胞决定的,图7)。而SC的分布大小观察最后装配和拆卸相似,有小SCs更强的偏好(88%)比在最后分解失败地拆卸(51%)(图7 d)。虽然罕见,15中、长SCs经历流产拆卸流产拆卸的动力学特征。喜欢最后的拆卸,拆卸是单相流产。然而,流产拆卸的平均速度低得多25±1 (SD)纳米/分钟和66±30 nm /分钟(SD)最后的拆卸。这些结果表明,流产SC拆卸和最后的拆卸是不同的。

讨论

两相的增长模型

在这项研究中,突触的实时动力学只有被可视化秀丽隐杆线虫(罗格和Dernburg, 2015),不依赖于生物体或突触重组到一对同源染色体。我们在这项研究检查染色体联会的动力学酵母,哪个更像人类,它取决于重组的配对和突触。使用一个zip3Δ在酵母突变体,我们能够明确遵循SC装配和拆卸从一个起始点在单个染色体。我们看到SC在生物动力学有明显的差异。与所报道的C。线虫,形成的动力学SC只适合一个伸长的速度,在酵母中,我们发现两相的伸长35%的时间。分析酵母表明突触的突触起始与大多数centromere-initiated SCs是单向(Tsubouchi et al ., 2008)。然而,一个SC起始位点zip3Δ负责突触的双臂,这意味着SC起始必须是双向的(即。从两个方向,一个单点)。双向的突触non-centric着丝粒可能占伸长的两率随着短臂完成突触前,离开长臂染色体联会独自完成。然而,降息的幅度(大于预期的双重下降如果伸长速率相等)表明,其他因素也可能造成不平等的延伸率等的起始点。

另一个选择是一个模型SC伸长的第二阶段较慢,可能是由于物理约束,增加SC长度变得长了。在这种情况下,我们会预期,两相的增长将更频繁地出现在SCs更长。与此一致的是,平均SC细胞表现出两相的生长长度较长(图5 e)。

一个有趣的可能性为观察到的两相的增长速度是速度较慢,可能是由于染色体连锁装置。因为在酵母,所有染色体末端都嵌入到核膜,染色体对,其他染色体可能被困和阻碍配对或对齐的SC形成(纳瓦罗et al ., 2022)。这将反过来阻碍突触,从而减弱的速度SC联锁装置的装配在该地区。提出,可以解决复杂的运动的裹入染色体的端粒的结束染色体可以逃脱(纳瓦罗et al ., 2022)。造成的延迟清理纠缠可能占Zip1组装的速度较慢。可能不会出现在这样的延误秀丽隐杆线虫不同寻常之处在于,只有一端的染色体与核膜有关,可能使联结更容易解决。

酵母SC伸长速度可能不会受到影响zip3Δ突变

总的来说,SC的生成速率基于酵母Zip1-GFP图像平均是67 nm /分钟,大约是两倍低于平均利率从线虫(150 nm / m) (罗格和Dernburg, 2015)。这就提出了一个可能性,要么酵母染色体联会将放缓,或者zip3Δ突变削弱突触延伸率。而SCs的数量减少zip3Δ突变体,一个完整的SCs恢复突变FPR3(Macqueen罗德,2009)。在fpr3 zip2double-mutant,抑制着丝粒染色体联会发起的删除,它允许细胞形成SC在所有染色体。他们发现,在fpr3 zip2SCs的累积长度每核相似的时候分没有显著不同于野生型。如果延伸率较慢zip3Δ比野生型突变体,我们就不会有预期的fpr3 zip2在野生型突变体达到野生型SC长度率。然而,我们不能完全消除的可能性Fpr3伸长速率有影响。是否完全地址zip3ΔSC伸长速率是野生型的代表SC伸长速率,未来发展,允许观察野生型的单染色体是必要的。

因素可能会影响整体的突触

非Zip1装配率影响因素的时间完成整个补的突触的染色体。在一些生物如果蝇,着丝粒染色体联会起始站点和他们已经配对在减数分裂的开始(Takeo et al ., 2011;Tanneti et al ., 2011)。在线虫,配对中心出现在染色体终端发起独立突触重组(Dernburg et al ., 1998)。线虫相比,SC在酵母和哺乳动物形成依赖于复合的早期步骤(吉鲁et al ., 1989;Dernburg et al ., 1998;Romanienko Camerini-Otero, 2000),可能延长阶段的突触和/或延迟其发病。配对的程度时突触可能影响突触的时机完成和生物体之间可能是非常不同的。生物体是依赖于复合突触倾向于使用这些重组网站发起的一个子集联会(乔伊斯和麦金2007;Tsubouchi et al ., 2008;Pyatnitskaya et al ., 2022)。因此,染色体联会完成取决于伸长的速度和使用的起始位点数量以及染色体的长度。某些酵母菌株的背景,包括SK1,可以达到完整的染色体联会在不到4 h (Padmore et al ., 1991),而BR株花大约11 h接受SC的形成。除非SC的生成速率显著不同的酵母菌株在这两个实验室,时间越短染色体联会表明等监管控制突触的数量和时机提升,可能是负责任的。

为突触起始阈值与减数分裂进程模型

我们量化Zip1-GFP积累在核监测细胞的活跃阶段SC装配和拆卸。我们发现染色体联会发起当Zip1-GFP水平达到相当水平在野生型和zip3ΔSC组件的细胞,这表明一个阈值积累SC形成之前就开始了。也有可能,而不是一个阈值,达到一个特定阶段的减数分裂进程许可证SC形成和Zip1水平只是巧合的是相同的在野生型和突变体。Voelkel-Meiman et al。(2012)监测突触在BR菌株1 - 6份Zip1,发现随着拷贝数的增加,突触开始之前。在阈值模型中,更高水平的Zip1 SK1 vs . BR菌株可能解释,在某种程度上,如何SK1突触前开始。它也符合事实通常SK1突触在polycomplexes面前。

Zip1的丰度较低zip3Δ突变体

见图4 b,在zip3Δ减少整体Zip1看到随着时间的推移与野生型相比。一种可能性是,SC结构本身稳定/维护Zip1-i.e的丰度。,Zip1 that is incorporated into SC may be less likely to degrade than Zip1 floating in the nucleoplasm. Perhaps it is the SC structure that stabilizes Zip1 thereby promoting its accumulation. Another possibility is that a feedback loop exists such that more Zip1 is produced as more is incorporated into chromosomes.

最后拆卸包括去除SC的结束

与随机装配各个染色体Zip1-GFP整个染色体结合阶段,最后SC拆卸所有突触染色体发生一次。Zip1的浓度居高不下,直到编程SC拆卸,突然在野生型和减毒zip3Δ。在这两种菌株SCs开始快速拆卸当Zip1水平开始下降(在1.5 hzip3Δ),这表明zip3Δ二倍体保留程序分解信号,但是他们可能会受到损害。SC的拆卸是单相的相似率组装。Zip1末端发生的损失,相反的集会。然而,在野生型细胞的可能性存在,拆卸也可能出现间隙,可能在染色体联会发起的网站。这是难以衡量由于明显的强度变化,伴随SC的取向的变化。

流产拆卸可能正确的染色体联会的一种方式

意外,我们遇到了许多SCszip3Δ核时,在决赛之前拆卸拆卸Zip1蛋白质是积极地退化。我们称这些SCs的拆卸为“流产拆卸”因为这些SCs未能坚持到突触的最后阶段。拆卸的流产拆卸流程表示SCs同时别人可以组装,这让人想起“动态稳定”现象在微管(柯式和Mitchison, 1986)。大多数这些SCs是很短的,但几大SCs观察。流产SCs也观察到野生型减数分裂,但技术上难以识别,因为许多例子SCs组装在同一时间,它可能是更罕见的事件。流产拆卸中没有观察到线虫(罗格和Dernburg, 2015)。我们的数据显示,30%∼5 h时间课程(表示突触时期的三分之一)有一个或多个流产SCs,暗示zip2Δ突变体,流产SCs是相当常见的。与我们的数据一致,检查固定核表示zip2减数分裂原子核并没有获得尽可能多的SCs野生型(Voelkel-Meiman et al ., 2019)。然而,动态组装和拆卸的SCs只能显示实时成像,照亮了财富从实时成像的数据,可以发现。一个预测未来在活的有机体内研究是流产拆卸应更频繁的混合菌株有很多多态性。

我们假设流产SCs还被认为是有缺陷的或停滞SCs无特征监测机制,然后针对拆卸。我们推测,许多中止SCs中确定zip2Δ突变体代表新生的SCs之间形成异源染色体。zip2 Fpr3,提出了一个角色在许可SC复合后形成在着丝粒启动(Macqueen罗德,2009)。因此,当本授权是有缺陷的zip2 fpr3,滥交的SC形成发生在spo11突变体,recombination-negative,迄今,没有同系物。zip2 fpr3双突变体达到野生型SCs但孢子可行性较低的水平,这意味着明显完整染色体联会无法救援zip2。似乎centromere-initiated突触,在缺乏监管的情况下,容易出错。这可以解释为什么大部分流产SCs非常短,因为缺乏同源性可能减缓伸长或可能是一个信号对SC堕胎或一些物理特性缺乏稳定性。也许这些短SCs,注定要消失的时候,可能没有建立一个健壮的核心要素。我们可以设想一个场景,在该场景中,这些短异源SCs在前期的telomere-led拽分离运动。也许由于异源和相对较短的,他们更容易受到端粒的拉。而不是寻找non-homology调用传感机制,可能的物理冲击染色体就足以破坏非生产性SCs。对于那些已经获得显著的SCs长度流产之前,他们可能是纠缠的结果与其他染色体。也许是粗线期检查点延长染色体联会阶段zip3Δ允许纠缠的时间分辨率。在未来,可能更精致的鱼实验如所示图1 d能测试的假设流产拆卸事件主要来源于异源交互。

在过去的几十年里,大量的基因在染色体配对和突触已确定,SC的蛋白质结构决定,然而,许多基本问题保持同调识别之间的联系、SC组装、联锁决议,重组,交叉分布。减数分裂的复杂动力学是原因之一,这些问题很难回答。遗传方法通常应用constant-in-time扰动,然后探头端点的结果。分析SC装配和拆卸的动态实时地提供了一个不同的看法相同的事件,一直通过基因手段探测,并揭示了意想不到的特性,比如两相的增长和流产的拆卸,没有预测遗传分析的基础上。我们的工作因此代表了一步机械理解减数分裂是一个动态的过程。

数据可用性声明

原始数据支持了本文的结论将由作者提供,没有过度的预订。

作者的贡献

议员进行大量的实验,导致分析和写作。BR导致了写作。AO的分段回归和统计分析。CA的原始菌株。摩根富林明进行的一些实验,有助于分析和写作和获得资金支持。

资金

这项工作得到了国家卫生研究院的基金5 R01GM137126和1 s10od010673-01(摩根富林明)。

确认

我们想感谢月桂Geraci解剖和野生型zip2突变体。我们要感谢蒂姆·纳尔逊博士和华莱士马歇尔的批判阅读手稿。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

审稿人是宣布过去与作者共同创作AO和摩根富林明处理编辑器。

出版商的注意

本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。

补充材料

本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fcell.2023.1098468/full补充材料

补充图S1-S3|在zip2 SC电影Δ菌株。二维投影电影的动态运动zip3ΔSCs。200毫秒间隔时间序列。S1-movie联系在一起图2一个。与9 SCs S2-movie。S3-movie 1 SC。

补充图S4| nonoptimal成像条件的影响。初步实验表明,酵母细胞的过度暴露的波长488纳米的激光功率大于30µW结果等光毒性的影响,形成Zip1发生聚合或染色体采用一个固定的配置和不再出现telomere-led拉(顶部和中部面板)。在我们的成像条件11µW,漂白率降低,没有观察到异常的染色体行为(下半部分)。数字表示。数据是在200毫秒的时间间隔。

补充表S1|酵母菌株。

补充表S2| SC长度从单相和两相的组装。

引用