肌腱维管束间的基底膜提供了一个对于CD146血管利基+细胞亚群

1介绍

肌腱是肌肉骨骼系统的基本组件,作为肌肉和骨骼之间的连接。跟腱的主要功能是骨骼肌收缩产生的力转移到骨头,定位的肢体运动(亚历山大,1991;本杰明et al ., 2008)。储能肌腱,然而,专业如马表面数字屈肌肌腱(SDFT)和人类的跟腱,提高肌腱的功能适应性降低能量消耗的运动通过他们的机械性能,如更大的可扩展性、弹性和抗疲劳性(Biewener 1998;亚历山大,2002;索普et al ., 2015)。就像骨骼肌,这些专业储能肌腱的力学性能提供了层次结构的单元主要由I型胶原蛋白,形成成簇,束束。神经束和束束都是包围,受non-collagenous维管束间的矩阵(也被称为endotenon IFM)控制储能SDFT的高应变行为通过促进神经束之间的滑动(Kannus 2000;索普和屏幕,2016年;Handsfield et al ., 2016)。IFM的机械作用在能量存储肌腱的功能是定义良好的,少即是已知的关于其生物作用在发展中,成人和老龄化肌腱,尤其是IFM本地化的身份和功能细胞群和他们的利基,定义为特定的解剖微环境细胞群。

腱的组织学分析揭示了区域形态不同的细胞群,IFM内圆细胞,存在于更大的数量相比,这些神经束内高度与肌腱的长轴(索普和屏幕,2016年;索普et al ., 2016)。此外,开创性的研究提到一个内生肌腱干细胞/祖细胞(TSPC)人口和利基市场,这两个在很大程度上仍未定义但一直猜测驻留在IFM (Bi et al ., 2007;理查森et al ., 2007;古德温et al ., 2012)。在其他组织中,干细胞利基是由机械独特的微环境,类似于在IFM高剪切环境,可能因此肌腱干细胞/祖细胞定位的位置(埃文斯et al ., 2013;Ivanovska et al ., 2015;史密斯et al ., 2018)。

肌腱发展是由干细胞/祖细胞群表达莫霍克同源框(类似MKX)和Scleraxis (SCX)转录因子(施韦策et al ., 2001;安德森et al ., 2006;木村et al ., 2011);不幸的是,他们的细胞内本地化阻碍细胞分选技术要求在体外研究干细胞/祖细胞数量。在成人组织,细胞表面标记,如CD44和CD90 (THY1)是一系列规范标志板的成员经常用于描述特定基质和隔离/干细胞数量(霍维茨et al ., 2005;纳et al ., 2016)。最近的研究也报道居民CD146人口肌腱(阴et al ., 2016;Gumucio et al ., 2020)。CD146或黑色素瘤粘附分子(MCAM;MUC18;Gicerin;人类:155735年)是一种跨膜糖蛋白属于免疫球蛋白超家族的细胞粘附分子(施,1999)。最初作为一个标记的肿瘤进展和转移特征,CD146已经被报告为一个标记的内皮细胞谱系,间充质干细胞和造血的血统,以及滑膜成纤维细胞和骨膜细胞(Johnson et al ., 1993;ser et al ., 1993;Schlagbauer-Wadl et al ., 1999;施拉格et al ., 2008;et al ., 2010);罗素et al ., 2010;Tormin et al ., 2011)。我们实验室最近报道说,这些CD146亚种群内存在IFM鼠阿基里斯和招募损伤从IFM利基网站通过CD146配体层粘连蛋白α4 (LAMA4) (马尔et al ., 2021)。然而,作者的知识,没有研究试图全面描述CD146肌腱细胞和他们的在活的有机体内细胞利基组成。

在这项研究中,我们测试了IFM的假设是肌腱祖细胞利基住房独家细胞亚群。我们报告小说标记的维管束间的细胞和基底膜,并确定CD146作为最佳标记用于IFM细胞排序程序。我们还表明,维管束间的CD146细胞的谱系的潜力和clonogenicity有限,这可能是指示性的分化血管人口而不是居民肌腱干细胞/祖细胞。

2材料和方法

2.1道德声明

动物组织的收集是通过英国皇家兽医学院伦理和福利委员会(urn - 2016 - 1627 - b)。所有组织都是来自马安乐死的原因与本研究无关,比肌腱损伤和其他商业马屠宰场。

2.2组织收购

肤浅的指屈肌腱(SDFT)从前肢从年轻,只是成熟的马(= 3 - 8岁,n= 5,运动历史未知)。在隔离之前,前肢被剪去除头发和皮肤消毒的几个应用4%洗必泰(HiBiScrub®;Molnlycke卫生保健)。部分mid-metacarpal SDFT(6 - 10厘米)立即被切割的肢体和存储在标准生长介质组成的丙酮酸和低葡萄糖杜尔贝科的修改鹰介质(DMEM)补充1% (v / v)青霉素、链霉素和10% (v / v)合格,heat-inactivated胎牛血清(的边后卫)直到组织处理(所有从Gibco™)。切除肌腱出现之前报道的定义宏观损伤的证据被排除在所有的实验(Webbon 1977;Dakin et al ., 2012),所有肌腱正常组织学外观。解剖和随后的细胞处理是安乐死的24小时内完成。

2.3 Cryosectioning

SDFT冻结部分准备如前所述(Godinho et al ., 2017)。组织简要洗在杜尔贝科的磷酸盐(钙、镁免费的,嵌入最佳切削温度复合(10月;细胞路径,英国新城)嵌入矩阵和snap-frozen pre-cooled己烷干冰。串行纵向(6 20µm厚度)和横向(30µm厚度)部分是准备使用低温恒温器切片机(OTF5000,明亮的仪器)配备MX35总理可支配低调的切片机刀片(3052835,费舍尔科学)。组织部分是安装在SuperFrost™+幻灯片(10149870,费舍尔科学),室温风干(RT)最多2 h和存储−80°C。

2.4定期acid-Schiff染色

周期性acid-Schiff (PAS)染色法用于检测黏蛋白和基底膜蛋白。使用一个阿尔新蓝染色进行(pH值2.5)/ PAS染色设备根据制造商指南(原子科学)。SDFT cryosections(20µm)解冻和固定PFA 4% / 10% NBF 10分钟rt,幻灯片和蒸馏水冲洗彻底,阿尔新蓝沾1% 3%醋酸(pH值2.5)10分钟,并在蒸馏水清洗彻底。幻灯片周期性的酸溶液处理1% 10分钟在RT,用蒸馏水洗净,然后用希夫试剂(福尔根氏)10分钟RT,部分被洗下运行直到用红色部分提出了一个宏观上自来水。与苏木素的部分然后counter-stained,脱水,并使用一个自动滑色料(Varistain清除^™双子座ES)和安装玻璃盖玻片用DPX mountant。幻灯片在一夜之间RT和成像使用治愈brightfield显微镜(DM4000B直立显微镜)徕卡应用程序套件软件2.6版本(徕卡微系统)。

2.5基于网络的预测CD146交互

蛋白质对immunolabelling选择基于他们的表情肌腱祖细胞亚种群在以前的报告(阴et al ., 2016)及其预测的相互作用科仕caballus(NCBI taxid: 9796)使用字符串(版本10.5)基于网络的预测对于CD146和LAMA4 (Szklarczyk et al ., 2017;Gumucio et al ., 2020)。

2.6 Immunolabelling

SDFT cryosections解冻和固定丙酮(pre-cooled−20°C) 10分钟,洗了三次5分钟在RT tris-buffered盐水(TBS),孵化在“阻塞”缓冲区(TBS补充1% (w / v)牛血清白蛋白(科学实验室用品),5% (v / v)山羊血清(σ)和5% (v / v)马血清(σ)2 h。马血清用于饱和Fc受体表面的组织内的细胞。一夜之间,部分被孵化与初级抗体在4°C(关于中小学抗体提供了细节补充表S1)。消极的控制,部分服用阻断缓冲区。同形像控制,部分治疗老鼠和兔子免疫球蛋白isotype-matched控制稀释在相同的浓度主要抗体阻断缓冲区使用。荧光检测(10µm部分)、二次抗体稀释阻断缓冲区被应用于部分和黑暗条件下培养1 h RT。部分和TBS 5分钟洗了三次,使用延长和安装玻璃盖玻片^™钻石不变色mountant 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)作为核复染色。幻灯片是治愈24 h RT在黑暗条件下,前成像。消极和同形像匹配控制荧光标签提供的图片补充图S1。免疫组织化学标签(6µm部分)以类似的方式进行荧光检测,使用一个设想®⁺双重链接System-HRP轻拍⁺系统(Dako),包含一个想象的双重内源性酶块在RT在黑暗条件下15分钟前治疗阻断缓冲区,和清洗步骤进行使用.05% TBS-TWEEN20 (v / v)。免疫组织化学检测,部分被孵化的设想过氧化物酶标记聚合物(共轭山羊anti-mouse和山羊anti-rabbit免疫球蛋白)为30分钟rt,部分被洗了三次与想象民建联孵化⁺衬底buffer-3 3′-diaminobenzidine (DAB)发色体解决方案3分钟,冲洗三次去离子水(diH₂根据Delafield O), counter-stained用苏木精,Varistain脱水和清除使用标准程序^™双子座ES自动滑色料,最后安装玻璃盖玻片用DPX mountant。幻灯片在一夜之间RT和成像使用治愈brightfield显微镜(DM4000B直立显微镜)徕卡应用程序套件软件2.6版本(徕卡微系统)。区域标记清晰显示IFM血管形态学和积极的结构选择展示蛋白质本地化。负控制图像提供了免疫组织化学补充图S2。

2.7荧光标签的分析

IFM区分地区和丛生的矩阵(FM)界限阶段都是由光折射相衬图片,以及核数和细胞形态学鉴定总值(补充图S3)。对于量化,所有样品包括接触之间设置保持不变,像素大小,z-step大小和激光设置在一个会话中拍摄的图像。对于每一个样品,两个截然不同的区域分别成像在两个串行组织部分(2×部分/马捐赠,n= 5)。共焦图像提出了从z-stacks包含最大强度投影图像片的分辨率512×512×40像素(227.9×227.9×13.09µm;点µm z-step大小)完全捕捉组织深度。图像处理和分析使用斐济/ ImageJ软件(Schindelin et al ., 2012)。IFM测量的面积比例(%)积极彩色像素的8位二进制图像(黑=负面,白=积极)衡量的利益表达的标记。为每一个标记,生成二进制图像进行背景校正消除噪音,紧随其后的是中值滤波和阈值(黄三角对于CD146 /类似MKX = 555海里,CD44 / CD90 = 633海里)。词根查找表(LUT)中的颜色通道图像改变了可视化的目的。

2.8 3 d immunolabelling

3 d immunolabelling SDFT段进行了如前所述(马尔et al ., 2020)。所有步骤进行轨道风潮。SDFT段(5毫米×5毫米×2毫米,n= 2)与TBS 12 h RT洗两次,和顺序permeabilised 50% (v / v)甲醇:TBS, 80% (v / v)甲醇:diH₂O, 100%甲醇在4°C 2 h。样本顺序洗了40分钟在4°C和20% (v / v) DMSO:甲醇,80% (v / v)甲醇:diH₂啊,50% (v / v)甲醇:TBS, TBS, TBS补充价格下跌0 (v / v)特里同x - 100。前阻止,样本孵化pre-blocking渗透缓冲区包含价格下跌0 TBS-TX100,。3 M甘氨酸和20% DMSO在37°C 6 h。马SDFT段被封锁在价格下跌0 80 h在37°C TBS-TX100补充6% (v / v)山羊和6% (v / v)驴血清和10% (v / v) DMSO溶液。主要抗体对于CD146孵化项目(1:10 0)进行了37°C 80 h的清洗缓冲(TBS补充价格下跌0 (v / v) TWEEN20), 3% (v / v)山羊血清,3% (v / v)驴血清,5% (v / v) DMSO溶液。段与洗水洗3×2 h缓冲区,孵化与二次抗体(摘要、山羊anti-rabbit Alexa萤石®594)36 h在37°C,洗5×5分钟洗缓冲区,和复染色过夜DAPI(1:20 00)稀释清洗缓冲。段脱水与甲醇浓度的增加,组织了沉浸在Visikol®HISTO™1 36 h,紧随其后的是沉浸在组织™2至少36 h rt,样本存储在组织™2共焦成像之前在4°C。共焦成像的区域(约。1毫米××1毫米。2mm) within each sample was performed using a Leica TCS SP8 laser scanning confocal microscope with a motorised stage. Images were captured using lasers emitting light at 405 (blue channel; DAPI) and 561 (red channel; Alexa Fluor 594) nm with laser power <10% and scanning speed = 600 Hz with a HC PL FLUOTAR 10x/.32 dry objective lens, resolution = 1,024 × 1,024 px, pinhole size = 1 Airy unit, frame average = 1, line average = 8, and electronic zoom = .75. 3D renderings were captured in Leica LAS X software (version 3.5.5) within the 3D module.

2.9主要肌腱细胞培养

SDFTs收集在无菌条件下被放置在培养皿中包含Gibco™杜尔贝科的PBS(无酚红、钙和镁)补充1% (v / v) antibiotic-antimycotic解决方案。周围peritenon被孤立腱芯(6克),这是丁到约4毫米³与DPBS块,冲洗,消化和1毫克/毫升链霉蛋白酶E(39052年,VWR)每1 g组织6 - 8 h在37°C和5%的公司₂在不断搅拌。链霉蛋白酶消化后,组织消化进一步24小时与5毫克/毫升胶原酶IV型(CLS-4, Lorne实验室)和1毫克/毫升dispase II(17105041,英杰公司)在37°C和5%的公司₂不断搅拌(Garvican et al ., 2017)。

2.10 Magnet-activated CD146细胞的细胞分类(mac)

之前的研究表明,> 50%的表达细胞膜蛋白质可以恢复post-digestion 24小时在体外文化(Autengruber et al ., 2012)。因此,增强抗原的复苏,新鲜消化tendon-derived细胞(TDCs)培养过夜最大化CD146细胞分解动作。这次复苏阶段后,附着在37°C细胞分离10分钟使用Accutase®方案根据制造商的指导方针。剩余细胞悬浮(即non-adherent人口)也收集与游离细胞(附着数量)。细胞分离洗了再悬浮在新鲜的生长介质和离心机在300 g×10 - 20分钟取决于颗粒的形成。细胞颗粒(通道1;p1)在生长介质和resuspended分为单细胞悬浮体(SCSs)通过一个70μm细胞过滤器。SCSs resuspended刚做好的,冰冷的mac缓冲区包含sterile-filtered FACSFlow™(342003年,BD生物科学)和1% (w / v) BSA补充。SCSs离心10分钟300×g, resuspended在mac缓冲区,细胞生存能力和数字由锥虫蓝(T8154 Sigma-Aldrich)和一个血球计。悬浮液与< 90%可行性被丢弃。 SCSs were incubated with anti-CD146 antibodies (ab75769, Abcam, Cambridge, United Kingdom) at a concentration of 1 μg/mL for 30 min at 4°C on ice. Following primary antibody incubation, SCSs were washed three times by centrifugation at 300 × g, resuspended in MACS buffer, and incubated with anti-rabbit IgG micro-beads (130-048-602, Miltenyi biotec) diluted in MACS buffer for 15 min at 4°C. SCSs were washed three times by centrifugation at 300 × g and resuspended in MACS buffer. MidiMACS™ LS columns (130-042-401, Miltenyi biotec) were mounted to a MidiMACS™ Separator and multistand (130-042-301, Miltenyi biotec) and washed with MACS buffer according to manufacturer guidelines. MACS-ready SCSs were passed through MidiMACS™ columns and washed with MACS buffer twice. All wash elutions containing negatively selected cells (i.e. CD146^{- - - - - -}TDCs)收集在冰上直到亚文化群处理。-细胞耗竭后,CD146⁺收集细胞通过删除mac列从mac磁铁和淋洗列mac缓冲区和柱塞。亚文化群都保持直到最多三个段落(p3)限制表型漂移。对于下游化验,细胞分离使用Accutase®(A6964 Sigma-Aldrich)的解决方案。n= 9(生物复制)。

2.11流式细胞仪

直流式细胞术,1。-。2×10⁶细胞在DPBS resuspended。对于CD146⁺细胞,低浓度使用mac隔离后根据收益率。所有管子都存储在冰立即之前,在流式细胞术。细胞悬浊液(50µl)孵化和藻红蛋白(PE)的共轭变体EPR3208 anti-CD146抗体(1:10 0,ab209298 Abcam,剑桥,英国)在冰上30分钟,清洗DPBS和旋转400×g。上层清液被移除,并在500年丸resuspendedµl DPBS立即流式细胞术分析。

执行所有流式细胞仪采集使用气冷式3-laser BD FACSCanto II™流式细胞分析仪(BD生物科学)配备BD FACSDiva(版本8.0.1,BD生物科学)。采集设备和软件校准每日或立即收购之前使用BD FACSDiva™CS&T研究珠(BD生物科学)。在FlowJo执行数据分析软件(版本10,FlowJo LLC)。清白的控件(荧光- 1控制)是用于门和歧视积极的和消极的标签数量(见Supplementaty图S4)。阳性细胞的百分比的清白的样本(即。从彩色样本,autofluorescent细胞)减去(即实验细胞)给一个总体比例的免疫反应性。所有实验记录至少10000事件(即细胞)。n每单元分数= 2(生物复制)。

2.12免疫细胞化学

检测CD146的无序TDCs, 1。-。2×10⁶细胞被播种在无菌16毫米硼硅玻璃圈盖玻片(涂上poly-L-lysine解决方案。01%,sterile-filtered P4832 Sigma-Aldrich)直到70% - -80%融合。检测CD146 MACS-enriched CD146之内⁺细胞,免疫细胞化学进行了直接在细胞(1。-。2×10⁶播种密度)在non-coated文化融合船只在70% -80%。细胞与DPBS洗3次,固定与pre-chilled (−20°C)丙酮:甲醇(1:1)20分钟在冰,然后用DPBS洗了三次。细胞被封锁1 h和阻断缓冲区如上所述。细胞孵化一夜一夜之间主要抗体在4°C如上所述,洗了三次DPBS,孵化1 h和二次抗体(1:50 0,山羊anti-rabbit Alexa萤石®488和山羊anti-mouse Alexa萤石®594)。

直接CD146标签MACS-sorted人群,细胞被孵化一夜之间在4°C藻红蛋白(PE)共轭anti-CD146抗体(1:10 0,ab209298 Abcam,剑桥,英国)。细胞被洗了三次DPBS,贴上了DAPI(1μg /毫升)2分钟,洗了三次DPBS和安装使用延长™钻石,在RT在黑暗条件下固化24小时后储存在4°C到成像。荧光成像的TDCs执行使用徕卡SP5 (40×HCX PL FLUOTAR PH2 NA =炮的目的)。对于CD146⁺细胞成像进行DMIRB倒置显微镜(徕卡微系统公司位于德国;40×N计划L corr PH2 NA = 55客观)。n= 3(生物复制)。

2.13单独分析

骨骨髓来源间充质基质细胞(msc)孤立如前所述请提供的博士会Sivelli (古德温et al ., 2012)。未排序CD146 TDCs, msc⁻细胞和CD146⁺细胞被播种在6-well板细胞密度100厘米⁻³(约。900细胞)和培养7 d。文化的终止,细胞被洗了3×DPBS, 2.5%戊二醛固定10分钟,然后洗了3×论文(所有步骤在RT)。细胞染色与物质(v / v)结晶紫为30分钟rt,细胞被洗3 x与论文,风干在沿图像获得使用平板扫描仪(4990年爱普生完美,爱普生)800 dpi的分辨率。n为每个单元格类型= 3(生物复制)。n= 2 - 3井为每个条件(技术复制)。

2.14脂肪形成分析

未排序CD146 TDCs, msc⁻细胞和CD146⁺细胞被播种到12-well板的密度。4×10⁵每口井的细胞培养48 h,直到坚持标准生长介质。诱导脂肪生成、标准增长媒体被删除,和细胞培养StemPro®脂肪形成分化媒体进一步14 d。细胞被美联储感应媒体文化,终止时的每72 h。单层膜与DPBS之前洗一次固定PFA 4% / 10%为30分钟NBF RT,评估细胞内脂质囊泡产生的脂肪形成的条件下,细胞被沾油红O .固定层与蒸馏水冲洗一次然后用60%的异丙醇洗5分钟在沿层彩色15分钟在RT 3:2工作解决方案三部分.3% (w / v)油红O稀释在异丙醇,1份蒸馏水。细胞与蒸馏水反复冲洗,直到冲洗沉淀油红O,然后用哈里斯苏木精复染色在rt,成像进行1分钟Axiovert 135电视倒置显微镜(蔡司)使用图像Pro洞察力版本9.1.4(媒体控制论)。n为每个单元格类型= 3(生物复制)。n= 2 - 3井为每个条件(技术复制)。

2.15骨生成分析

分离后,msc,未排序CD146 TDCs,⁺和CD146^{- - - - - -}细胞被播种到12-well盘子。1×10的密度⁶每口井的细胞与成骨的媒体包含2毫米磷酸氢二钠(DiP)或标准生长培养基作为控制与每个条件补充50μg /毫升促进胶原蛋白合成的抗坏血酸(巴恩斯,1975;帕特尔et al ., 2019)。磷酸浸渍(免费捐赠)骨/矿化是至关重要的细胞外基质代谢在骨(罗比和Termine, 1985)。层被喂食新鲜half-media变化对应于每个条件每72 h。细胞培养是21天来评估后终止与茜素红S染色(矿化泰勒et al ., 2014)。单层膜与DPBS冲洗一次然后在RT固定10分钟2.5% (v / v)戊二醛。固定细胞冲洗一次论文然后三次以70%乙醇和风干一夜之间在RT。干层随后沾1% (w / v)茜素红S diH₂在RT O 5分钟,然后用50%乙醇洗涤三次,在一夜之间就风干。成像进行如上所述。n为每个单元格类型= 3(生物复制)。n= 2 - 3井为每个条件(技术复制)。

2.16统计分析

统计分析和图表是利用GraphPad棱镜(版本9.1)。根据Shapiro-Wilk正常测试进行测试(α= . 05)。所有数据集通过正常测试和使用未配对的双尾t检验进行分析(意义p< . 05)。图形绘制,意思是(µ)±标准差(SD)。

3的结果

3.1 CD146标记的维管束间的细胞群

PAS染色显示,IFM包含mucin-rich基底膜(图1一个)。使用CD146和IFM基底膜标记LAMA4在弦预测确定几个潜在的维管束间的细胞表面标记包括CD44, CD90 (THY1)和CD133 (PROM1),以及更广泛的网络的维管束间的利基和基底膜组件,包括dystroglycan 1 (DAG1),整合素亚基β1 (ITGB1)和纤连蛋白1 (FN1) (图1 b)。来验证这些提议的维管束间的细胞标记,荧光标签CD44, CD90 CD146和类似MKX量化成束的和维管束间的区域。所有标记都浓缩在IFM(72% - -94%的积极表达)和神经束内表达显著减少;丛生的CD146表达低于1%而CD44, CD90和类似MKX表达式在4%和15%之间(图1 c-j)。使用3 d成像与CD146 SDFT贴上标签,我们确定了一个维管束间的血管网络结构中CD146细胞局部(图2一个)。肌间线蛋白colocalisation(壁画细胞标记)和CD31(内皮标记)和CD146 (pan-vascular标记),与LAMA4(基底膜;图2罪犯)横向部分证实了结构中观察到血管,并经常发现地区的IFM连接3邻成簇。IFM之内,我们观察到明显的CD31内皮Desmin-rich层包围,同时CD146和肌间线蛋白colocalised在平滑肌和外膜细胞层。标签的CD31 CD146和肌间线蛋白也证实血管层大血管内epitendinous区域(补充图S5)。

3.2钢筋束维管束间的矩阵是丰富内皮基膜

的分布特征维管束间的基底膜的主要成分,我们执行immunolabelling基底膜蛋白的纵向肌腱部分,包括完整的层粘连蛋白(pan-laminin)、IV型胶原蛋白和Perlecan (图3 a - c),所有这些局部的IFM的脉管系统。进一步与内皮标记标签endomucin (EMCN)和血管性血友病因子(VWF)展示了丰富的表达在IFM (图3 d, E)。字符串的预测科仕caballus确定规范的基底膜组件整合素β1 (ITGB1)和dystroglycan 1 (DAG1) CD146-LAMA4交互网络的一部分。因此,我们的执行标签α-dystroglycan (IIH6)和ITGB1 (图3 f、H),除了network-predicted细胞表面标志物CD133 (图3 gIFM)与所有三个标签丰富。LAMA4 / LAMA5比率对基底膜完整性(至关重要Galatenko et al ., 2018),我们还演示了对层粘连蛋白标签α5 (LAMA5)在IFM (图3我)。我们还研究了其他血管生成介质,Netrin-1 (NTN1);CD146的报道配体,Neuropilin-1 (NRP1),这两个也本地化IFM (图3 j, K)。除了展示这些血管的存在和基底膜标记IFM,我们的研究结果强调IFM脉管系统的变化和形态学SDFT mid-metarcarpal地区,与一个复杂的血管网络的横向和纵向部分,以及3 d成像(图2)。

3.3维管束间的CD146⁺细胞是一种罕见的族群需要浓缩在体外隔离

在从SDFT隔离,在体外细胞表面标记的标签表明,绝大多数的TDCs展出丰富的CD44和CD90标签和有限CD146表达(图4 a - c)。研究CD146细胞在体外,因此,我们开发了一个mac程序CD146浓缩的细胞。免疫细胞化学的积极排序CD146细胞细胞表达CD146证实浓缩(图4 d)。单个应用程序的mac电脑能够产生CD146细胞浓缩的大约64%由流式细胞术(图4 e, F)。手机号码前后mac的对比分析结果显示,大约有2%的无序细胞CD146 (图4 g),提供进一步强调CD146的稀有细胞亚群和要求最优浓缩过程。然而,一些CD146细胞中发现负分数(约。14%;图4 h)。

3.4维管束间的CD146细胞分化潜力有限

评估其clonogenicity和multi-lineage潜力,无序TDCs, CD146⁺CD146⁻细胞受到克隆细胞,成骨、脂肪形成的化验使用msc作为积极的控制。CD146⁺细胞没有表现出增强clonogenicity相比CD146-negative细胞或异构TDCs (图5模拟)。脂肪形成,TDCs CD146⁺和CD146⁻细胞所有显示有限的脂肪形成的潜在刺激时(图5情况)。在成骨的条件下,无序TDCs显示广泛的钙沉积和矿化结节,然而几乎没有钙沉积和矿化CD146中检测出⁺和CD146⁻排序的细胞群(图5 mp)。

4讨论

在这项研究中,我们已经描述CD146⁺在肌腱IFM细胞群和他们的利基。我们证明CD146⁺IFM在健康肌腱细胞完全本土化,形成广泛的相互关联的三维网络,组成一个利基含有血管基底膜和vascular-associated细胞和蛋白质,其中几件物品已经被确认IFM首次。与我们的假设IFM是祖细胞,CD146⁺细胞表现出有限的分化潜能,表明他们不太可能干/祖细胞,血管的,相反有可能推导。

CD146的存在⁺肌腱细胞之前已经证明;人类致命的immunolabelling显示中CD146 IFM (阴et al ., 2016)。我们的研究结果支持这些发现。此外,RNA单细胞测序人类肌腱CD146显示三个细胞群;其中一个是一个内皮人口中的CD31 (肯德尔et al ., 2020)。此外,在单细胞分析鼠标肌腱CD146⁺肌腱细胞,确定为造血的细胞,代表大约9%的TDCs (De Micheli et al ., 2020)。在其他组织如骨骼、CD31和CD146表达可用于描述骨内膜的人口和血管重塑造血的利基(Sacchetti et al ., 2007;Tormin et al ., 2011)。先前的研究从我们集团强调CD31作为IFM-localised血管标记(Godinho et al ., 2017),而其他的研究报道肌间线蛋白外膜细胞和肌细胞标记(Chan-Ling et al ., 2004;皮尔西et al ., 2007)。与肌间线蛋白CD146的本地化和CD31在此我们报告表明CD146⁺划定IFM内皮和壁画的人群,而CD31区分内皮细胞与肌间线蛋白⁺平滑肌细胞和周。事实上,互联网络CD146积极性检测演示了一个相互关联的存在IFM血管网络,可能持续整个肌腱。虽然研究表明血管化的IFM SDFT和跟腱(Kraus-Hansen et al ., 1992;艾哈迈德et al ., 1998),这些船只的丰度和复杂性没有升值。此外,epitendinous船只(即。相比,动脉和静脉)不同的维管束间的小动脉,毛细血管和小静脉,观察到的差异,平滑肌层和全船。因此,未来的研究需要提高腱脉管系统分类和vasculature-associated肌腱细胞体内平衡和修复的作用。

此外,最近的研究已经证实CD146⁺细胞迁移到网站大鼠跟腱的损伤,这是伴随着增加LAMA4表达式(马尔et al ., 2021)。在当前的研究中,3 d成像CD146 SDFT揭示了一个广泛的互联网络的IFM内标签;这些发现表明,CD146⁺细胞内发现,分离的脉管系统。然而它尚未确定这些是两个不同的细胞群,还是vascular-associated CD146细胞可以迁移远离脉管系统。CD146形式结构的互联网络与相似的3 d成像LAMA4 SDFT (马尔et al ., 2020)。CD146的colocalisation LAMA4在当前的研究中进一步CD146的假定的中的交互和LAMA4份额,先前的研究已经证明了(石川et al ., 2014;Wragg et al ., 2016)。在软骨细胞,阻断LAMA4抑制集群的形成,这是典型的病态的软骨,Claudin-1的差别,也导致了对这些(之前确认为腱IFM蛋白)和MMP3 (Fuerst et al ., 2011;Moazedi-Fuerst et al ., 2016)。最近的研究已经证实LAMA4导致损失减少CD146表达细胞和基底膜/利基维护损失间叶细胞和造血的环境(Cai et al ., 2022)。因此,LAMA4可能作为维管束间的迁移归巢受体CD146⁺tenocytes,然而趋化因子促进这个尚未确定。

在这里,我们表明,LAMA4和LAMA5 IFM利基中的丰富,与其他血管组件ITGB1、VWF、EMCN, NTN1 NRP1。它已被证明之前的早期阶段删除层粘连蛋白α4-chain不是由其他功能补偿层粘连蛋白链导致失败的血管生成发展。然而,相比之下,补偿的upregulation LAMA5 LAMA4损失结果的结果在一个相对温和的血管在产后成熟表型,这表明层粘连蛋白亚基之间的平衡LAMA4 / LAMA5比率对于保持健康是至关重要的血管网络和血管利基(Thyboll et al ., 2002)。鉴于LAMA4和LAMA5发现的丰富的表达在我们的研究中,很可能是两种链及其长篇层粘连蛋白亚型411年和511年IFM内皮基膜功能至关重要,由于他们在剪切应力响应和转导(之前报道的作用Di Russo et al ., 2017;Beguin et al ., 2020)。

原位IFM细胞CD44阳性和CD90。虽然他们的表达有可能获得在后期的分化和增殖。这些标记被用来标签假定的干细胞/祖细胞群在肌腱和其他组织(Leonardi et al ., 2021)。然而,考虑到整个IFM标记被广泛表达和神经束,它不太可能,他们专门标签肌腱干细胞马SDFT标签几个人口肌腱,包括tenocytes神经束内的居民。这个断言是由单细胞RNA从鼠标跟腱测序数据显示表达CD44和CD90 tenocytes和其他肌腱细胞群(De Micheli et al ., 2020)。

识别多个血管结构使用的标记内皮/血管细胞谱系表明IFM房子专门血管利基,丰富的基底膜蛋白质。这是建立在我们之前的蛋白质组学数据显示浓缩IFM的基底膜蛋白,包括perlecan、层粘连蛋白和IV型胶原蛋白索普et al ., 2016)。perlecan-rich血管网络的识别在肌腱IFM肌腱研究具有重大的影响。在开发期间,perlecan积分紧包装的间质组织,这房子脉管系统,以确保成熟内皮组织的收益(Gustafsson et al ., 2013)。此外,间质内lymphangiogenesis组织被定义为perlecan的表达和组织液流(资助et al ., 2006)。在肌腱,丛生的滑动可能因此积分IFM淋巴管和血管重塑。此外,VWF有可能作为内皮细胞维管束间的基底膜内的配体。血管基底膜的组装是由β1-integrins dystroglycans,通常形成IV型胶原蛋白,蛋白聚糖如perlecan以及血管层粘连蛋白亚型由LAMA4和LAMA5 (Nikolova et al ., 2006;Thomsen et al ., 2017)。先前的研究已经报道血管细胞的住房CD146-expressing干细胞/祖人口(Castrechini et al ., 2010)。此外,CD146的血管生成能力是由信号分子如Netrin-1 Neuropilin-1;这两个是血管细胞模式的关键Melani温斯坦,2010年;图et al ., 2015;陈et al ., 2018)。值得注意的是,上述的一些蛋白质,其中大部分预计将与CD146交互,IFM本土化,指示拘束CD146细胞血管基底膜。

在体外,腱细胞表现出类似的蛋白表达原位,丰富的CD44和CD90、标签和标签有限CD146 TDC的只有2%。这是略低于9%的细胞在鼠标阿基里斯CD146表达由单细胞测序(De Micheli et al ., 2020);这种差异可能是用特有的差异来解释。马模型是一个高度相关的和广为接受的模型人类阿基里斯肌腱研究SDFT和分享类似的功能,结构和受伤的风险(英纳斯和克莱格,2010年;Patterson-Kane和丰富,2014年)。另一种解释这种差异的人口比例的epitenon在最近的研究中,这是众所周知的,房子CD146⁺细胞(马尔et al ., 2020)。成功采用mac丰富CD146人口,大约有65%的细胞阳性CD146 post-sorting由流式细胞术。这个比例很可能让CD146⁺细胞用流式细胞术检测立即发布MACS-enrichment。这表明一些CD146抗原可能仍然被绑定到磁标签中使用mac,呈现他们无法绑定到荧光标记的抗体,因此通过流式细胞术一级。事实上,CD146的免疫细胞化学⁺细胞显示,几乎所有细胞标记对于CD146积极post-MACS浓缩。然而,负面的比例选择细胞CD146表达细胞排序后,可能由于CD146少量⁺细胞不绑定的列,因此被筛选了负分数。浓缩可能已经提高了额外的轮排序;然而,这将导致细胞数量不足为下游实验。

尽管先前的研究已经报道CD146的标记间充质干细胞谱系,tendon-derived CD146种群表现出类似clonogenicity其他TDCs,以及有限的分化潜能。这些研究结果与先前的研究一致,证明马SDFT-derived TSPCs clonogenicity有限和分化潜能;本研究利用低密度电镀与细胞排序程序获得TSPCs但仍未能发现脂肪生成后刺激(威廉姆森et al ., 2015)。在最近的研究中,然而生产数量有限的脂质囊泡是adipogenic-induced TDCs, CD146⁺和CD146⁻细胞。不幸的是,我们无法评估软骨形成后由于CD146的不足数量排序⁺在chondrogenic颗粒诱导细胞micromass生存。在一起,这些结果表明,CD146⁺tendon-derived细胞没有表现出干细胞可塑性,而是CD146肌腱pan-vascular标记,标签壁画和内皮细胞。虽然已经证明了周的multipotency一系列物种(斯特维斯和Donadeu, 2018),其他研究已经表明,外膜细胞可塑性不同组织类型之间,一些有限的分化潜能(周围的周赫曼et al ., 2016)。是可能的,尽管腱周有限多能——他们可以区分tenogenic血统,事实上单细胞测序数据显示,周是一个成人的祖细胞来源tenocytes小鼠肌腱(De Micheli et al ., 2020)。然而,当我们没有评估tenogenesis CD146亚种群,我们无法证实这一点,因此未来的研究将需要完全描述CD146的亚种。作为肌腱CD146⁺受伤的人群已经被证明迁移到网站,建立进一步的理解当地的微环境,家族的起源,在体外特性和老化的影响将有助于未来的研究旨在建立如果动员这些人群可以增强内在修复。

5的结论

CD146划定一个IFM-specific驻留在一个利基富含细胞基底膜和血管蛋白在肌腱。与我们的假设相反,CD146⁺细胞clonogenicity有限和分化潜力表明它们不太可能干细胞/祖细胞。相反,co-localisation肌间线蛋白和CD31 CD146表明CD146 pan-vascular标记内的肌腱。以前的研究已经表明CD146细胞迁移到网站的损伤,建立再生策略,利用内生肌腱细胞群促进内在修复可以作为一个可行的和有效的方法提高愈合反应,防止肌腱re-injury。

数据可用性声明

最初的贡献提出了研究中都包含在这篇文章/补充材料,进一步的调查可以针对相应的作者。

作者的贡献

概念化,纳米和CT;方法论、纳米、房颤、DW和CT;调查、纳米和DZ;原创作品草稿准备、纳米和CT;writing-review和编辑、纳米、DZ,房颤,DW, CT, JD和美联社;监督、CT、JD和美联社;项目管理、CT;融资收购,CT。所有作者已阅读及同意发布版本的手稿。

资金

这项研究是由与关节炎(批准号21216和22607年)。

确认

作者要感谢伊莎贝尔鸢尾草和露西伯恩博士对矿化支持和指导的文化。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

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补充材料

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