假设和理论文章

前面。细胞Dev。杂志。,10 January 2023
秒。分子和细胞繁殖
卷10 - 2022 | https://doi.org/10.3389/fcell.2022.1082657

Hypoxia-sensitive microrna的监管通过CRISPR / dCas9装载在混合动力液:一项新策略来提高胚胎植入和预防孕期胎盘机能不全

此前Yaghoobi ¹ ^__

Yasaman Nazerian ¹ ^__

阿尔曼Zeinaddini Meymand ¹ ^__ www.雷竞技rebatfrontiersin.org

阿里安萨里¹ ^__

Amirhossein Nazerian ²

哈桑Niknejad ¹*

¹医学院药理学系Shahid Beheshti医疗,德黑兰,伊朗
²伊朗大学医学院的医学科学,德黑兰,伊朗

辅助生殖技术作为一种新的再生医学方法大大促进了解决不孕问题影响全世界大约有15%的夫妻。然而,的成功率在体外受精周期仍只有20% - -30%,和75%的这些损失是由于植入失败(妊娠)的至关重要的病原反应一步。植入失败和异常胎盘的形成主要是由于有缺陷的附着力,入侵和血管生成。胎盘机能不全危及母亲和胎儿的健康。因此,我们提出了一个新奇的治疗策略,改善子宫内膜接受和移植的成功率。在这个策略,调节mir-30d表达式作为上游转录组胚胎移植结果的修改器修改相关基因的表达在胚胎粘附,入侵和血管生成,从而阻碍植入失败。为此,“脚手架/矩阵附件地区(S /火星)”是受雇为病毒性游离向量,使转染exosome-liposome混合载体的滋养层。这些向量组成CRISPR / dCas9专门指导RNA诱导miR-30d在低氧应激条件下的基因表达。为了避免担心胎儿的遗传操作,向量将转染专门到囊胚的滋养层层通过绑定到滋养层Erb-B4受体没有进入内细胞团。另外,S / MAR游离向量不整合与原细胞DNA。作为一个开/关监管开关,hypoxia-sensitive dCas9上游启动子()一定是局部的。miR-30d表达增加植入之前和期间和胎盘机能不全的条件和消除缺氧后熄灭。这个假说强调改善附着力,入侵和子宫血管生成微环境在怀孕期间会导致增加植入成功和减少胎盘机能不全,是转化医学的新见解。

1介绍

不孕一直成为一个全球的问题。今天,15%(约5000万)的生殖期的夫妻面临不孕(比较。。Gynecol 2020;Zhang et al ., 2022),这个数字似乎上升因为推迟怀孕的(Bouzaglou et al ., 2020;格里克et al ., 2021)。因此,在过去的四十年里,4000万名患者寻求不孕症治疗被称为辅助生殖技术(ART),和700万年新生儿出生通过体外受精(IVF) (施et al ., 2017;黑田et al ., 2018)。然而,尽管试管婴儿技术的快速发展,成功妊娠的可能性仍在每个试管受精周期20% - -30%。百分之七十五的这些损失是由于植入失败的至关重要的病原反应一步妊娠(Niederberger et al ., 2018)。与此同时,一些女性经历反复IVF周期没有建立临床怀孕,一个条件被诊断为复发性植入失败(RIF) (考夫兰et al ., 2014;Makrigiannakis et al ., 2021)。无论潜在疾病,损伤在每一个阶段,包括粘附、入侵和血管生成,可能导致移植失败(考夫兰et al ., 2014;Moreno-Moya et al ., 2014)。

附着力、入侵和血管生成的上下文中发生双向embryo-maternal沟通。这种通信发生在复杂的分子信号通路,包括粘附分子、细胞因子,趋化因子,生长因子是衍生品的胚胎或子宫内膜(Vilella et al ., 2015;官员et al ., 2019;福井et al ., 2019)。这些协调的一系列行动最终形成一个适当的子宫微环境,被认为是接受子宫内膜(Thouas et al ., 2015;Salamonsen et al ., 2016)。子宫内膜接受能力主要受荷尔蒙的反应和相互分子胚胎和子宫内膜之间的通信,而人们以前认为激素反应是单独负责准备接受子宫内膜(哈特et al ., 2022)。

升值后分子通信在子宫内膜接受能力的至关重要的作用,细胞外囊泡(EVs)研究了小说在细胞间的通讯工具。电动汽车可以传递不同的核酸等大分子(DNA、mrna和小分子核糖核酸)、细胞间脂质,蛋白质(Governini et al ., 2021)。在之间,小分子核糖核酸被认为是一个关键的基因表达在植入的监管机构(Andronico et al ., 2019;哈特et al ., 2022)。小分子核糖核酸(microrna)年龄在18岁至25岁之间的非编码核苷酸链调节基因转录后修饰和参与多种细胞间的相互作用以及embryo-maternal相声在植入(加里亚诺和浅色,2014;梁et al ., 2017)。microrna大多包含在液和被认为是至关重要的生物活性分子对胚泡植入胚胎发育期间和embryo-maternal通信(Bridi et al ., 2020)。

在microrna, miR-30d角色一直是研究人类子宫的活组织检查(梁et al ., 2017;Bridi et al ., 2020)。miR-30d是一个上游信号分子,其upregulation导致子宫内膜雌激素和孕激素受体的表达增加,生活在子宫和滋养层,集成和粘附分子包括整合素级别alpha - 7 (ITGA7),整合素β3 (ITGB3) cadherin-5 (CDH5)以及COX2酶。最终,这些信号分子和结构的upregulation提高子宫内膜接受和改善胚泡粘附,入侵和血管生成(Vilella et al ., 2015;梁et al ., 2017;官员et al ., 2019;Timofeeva et al ., 2019)。2019年,(官员et al ., 2019利用小鼠模型来评估miR-30d缺乏对妊娠的影响。他们表明,产妇或胚胎miR-30d不足导致减少植入,胎盘形成,胎儿生长(官员et al ., 2019)。

的潜在作用microRNA-30d RIF患者已经在先前的研究讨论。RIF病人miR-30d表达水平较低,SOCS1表达水平增加,较低的子宫内膜和血液水平的生活,表达下调JAK-STAT3通路(Altmae et al ., 2013;Arias-Sosa et al ., 2018)。miR-30d可以抑制SOCS1,因此提高生活水平和激活JAK-STAT3通路。所以,miR-30d似乎改善子宫内膜接受移植失败的主要原因之一(Altmae et al ., 2013;林et al ., 2017)。

克服艺术的挑战,我们提出了一个新颖的策略移植miR-30d表达式作为上游信号分子增加成功妊娠的概率提高胚泡粘附,入侵,和血管生成以及即将到来的怀孕期间胎儿存活。简而言之,该战略包括设计一个游离向量基于支架/矩阵附件区域(S / MAR)主要由CRISPR / dCas9指导RNA,缺氧敏感启动子(HIF-1敏感),开/关开关和强力霉素敏感。向量将被转移到囊胚滋养层专门设计的液,避免担心胎儿的遗传操作。然后,囊胚转移到子宫通过体外受精。

2支持证据的策略

2.1子宫内膜接受和植入

移植被认为是胚胎和子宫内膜表面之间的双向互动,包括粘附、入侵和血管生成。这个复杂的过程发生在大约3-5-day间隔期间子宫内膜的接受能力。这个阶段是至关重要的附加滋养外胚层层和随后的入侵和血管化的胚胎。有限的时间在mid-luteal阶段植入子宫接受是定义为“植入”之窗(WOI),与一个特定的基因表达谱适合胚胎附件和住宿。移植失败的主要原因是怀孕损失在辅助生殖技术(ART),它主要源于子宫内膜接受受损或低质量的胚胎。这两个是植入失败的关键原因,流产,RIF的人接受试管受精(西蒙和Laufer, 2012年;Lessey和年轻,2019年;Enciso et al ., 2021)。孕产妇RIF的原因包括解剖异常、血栓形成倾向,感染、遗传改变,免疫因素和子宫内膜接受(西蒙和Laufer, 2012年;Bashiri et al ., 2018;Makrigiannakis et al ., 2021)。研究已经证明,RIF病人患有子宫内膜接受相对较低的胚胎移植(Ruiz-Alonso et al ., 2013)。

广泛的参与RIF病因,但确切的机制不正确理解(西蒙和Laufer, 2012年;Bashiri et al ., 2018)。因此,寻找进一步参与植入失败的分子机制是至关重要的。与此同时,小分子核糖核酸(microrna)是潜在的信号通路参与胚胎植入的调节器(加里亚诺和浅色,2014;周et al ., 2020)。

2.2 microrna和怀孕

microrna是年龄在18岁至25岁之间的非编码核苷酸链作为转录后基因修饰符。microrna充分参与调节正常细胞的发展,包括细胞分化、增殖、凋亡、胚胎早期发育,embryo-endometrial沟通,子宫内膜接受,植入,decidualization,和胎盘的形成(加里亚诺和浅色,2014;Kolanska et al ., 2021)。研究表明,胚胎和子宫内膜之间的双向通信,同时分泌特殊的小分子核糖核酸,可由另一方和影响植入过程(梁et al ., 2017)。这些分泌microrna相当稳定,可以在胚胎培养和子宫液,使其潜在的非侵入性生物标记确认胚胎质量。

一些研究表明,受损的microrna的表达有助于RIF。过表达和under-expressed子宫内膜microrna的模式在RIF的mid-secretory阶段已报告的病人相比,肥沃的女性(陶醉et al ., 2011)。子宫内膜microrna的表达是不同的在WOI子宫内膜受损。先前的研究已经显示独特的不规则105 microrna的表达个人与RIF (施et al ., 2017)。之间也存在正相关upregulation这些microrna并成功的植入冷冻胚胎移植后24小时。Downregulation mir - 198, mir - 522, mir - 891已经植入失败所示(公园et al ., 2014)。Kuokkanen et al ., (2010)显示12个microrna的表达水平较高,在mid-secretory阶段包括miR-30d,月经周期(Kuokkanen et al ., 2010)。此外,子宫内膜和血清mir - 203的表达,miR-31, miR-30b, miR-30d尤其是不受监管的植入期间(Kresowik et al ., 2014)。其他研究也表明,microRNA多态性显著不同个体间RIF和肥沃的控件(李et al ., 2019)。所以,microrna可以用作植入过程的监管机构。

在胚胎植入2.3 miR-30d作用

MicroRNA-30d充当关键协调员embryo-maternal相声和调节许多基因表达参与人类胚胎植入。microrna的表达模式分析显示的重要upregulation miR-30d接受人类子宫内膜上皮细胞层的mid-secretory早期阶段与pre-receptive子宫内膜(Altmae et al ., 2013;Moreno-Moya et al ., 2014)。人类子宫内膜分泌自由形式或exosome-coated miR-30d胚胎中流体(EF),在胚胎植入前胚胎可以把它通过滋养外胚层层(图1)。同时,治疗小鼠胚胎miR-30d导致胚胎粘附率增加,而使用特定miR-30d抑制剂导致减少粘附率。此外,粘附分子等整合素β3,整合素,级别alpha - 7和cadherin-5调节后mir-30d治疗(Vilella et al ., 2015)。也表明miR-30d在小鼠和人类有同样的目标结果扩展到人类(Vilella et al ., 2015)。

图1

图1。Embryo-Uterine分子信号注入和miR-30d在胚胎植入的角色:植入过程包括三个主要步骤:附着力,入侵,血管生成,促进成功的植入。表达mir-30d胚胎植入的修改器修改其转录组,导致超表达的基因参与胚胎粘附,入侵,血管增生和子宫内膜接受。(1)MiR-30d促进激活LIF-induced STAT3通路,可能通过表达下调SOCS1在胚胎和子宫内膜。(2)SOCS1抑制生活/ JAK / STAT3信号通过抑制木菠萝的激活。(3)生活激活gp130 / STAT3信号通过绑定LIFR和gp130异质二聚体在子宫内膜和胚胎。激活STAT3(4)诱导粘附增加整合素的表达,级别alpha - 7整合素β3,以及(5)促进血管生成,诱导VEGF表达和(6)侵袭性的滋养层细胞基质金属蛋白酶的激活转录。人类子宫内膜分泌miR-30d(7),(8)然后exosomal has-miR-30d被胚胎滋养层和交付给流体(EF)修改胚胎转录组。

官员等人显示产妇miR-30d缺陷之间的关系,减少子宫内膜接受标记,导致减少植入率和受损的老鼠体内的胎儿发育(官员et al ., 2019)。此外,miR-30d转染人类子宫内膜上皮细胞系的诱导丰富的mrna和蛋白的表达与胚胎粘附,植入和发展(Moreno-Moya et al ., 2014)。

在2021年的另一项研究,表明miR-30d-5p表达水平相比,大大减少了RIF的女性平均肥沃的女性(赵et al ., 2021)。miR-30d-5p,差别也可能负责SOCS1对这些最终抑制激活LIF-induced STAT3通路。除了胚胎粘附,miR-30d提高子宫内膜血管生成抑制MYPT1和顺向VEGF激活(林et al ., 2017;赵et al ., 2021)。因此,miR-30d所带来的影响和相关途径植入可以改善结果。

2.4附着力、入侵和血管生成相关的信号通路

Upregulation特定的分子途径参与人类胚胎植入在WOI被发现。粘附分子等整合素β3、cadherin-5 L-selectin,粘蛋白1 (muc 1)中扮演至关重要的角色并置和附着力。生长因子如胰岛素样生长因子1 (IGF), heparin-binding表皮生长因子(HB-EGF)和血管内皮生长因子(VEGF)本质上是要求开发一个正常的血管网络。此外,炎症反应增强子宫内膜接受WOI期间通过炎性细胞因子,包括il - 1、il - 6,和白血病抑制因子(生活),调节孕期母婴互动影响和至关重要的胚胎植入,滋养层生长和分化(Trolice Amyradakis, 2012)。生活/ gp130 / STAT通路对胚胎植入也至关重要,因为这是血管生成关键。生活行为通过gp130 / STAT3信号的激活和随后的VEGF表达。生活糖蛋白表达水平增加WOI期间正常的分泌阶段肥沃的女性。相反,在RIF患者中,分泌期的生活水平下降(Hambartsoumian 1998)。此外,子宫内膜和血液RIF患者的认识提高了生活水平,其次是怀孕失败(Comba et al ., 2015)。

也有明显降低蛋白质和mRNA水平制药业和gp130在大多数女性不明原因的不孕和RIF增殖和分泌阶段(Hambartsoumian 1998;Tawfeek et al ., 2012;赵et al ., 2021)。杂合的生活的基因突变导致减少的生活活动和可能在一些女性不孕的原因(为研究et al ., 1999)。此外,生活/ JAK / STAT3通路参与了子宫内膜的血管生成和胎盘通过诱导VEGF表达。生活也积极影响整合素的表达,VEGF本身归纳整合素的表达,所以他们在诱导粘附(至关重要阿尔夫et al ., 2017)(图1)。

所示图1,激活JAK /生活/ STAT3还参与促进入侵通过增加的表达基质金属蛋白酶(Suman et al ., 2013)。Upregulation JAK / STAT3通路的负面影响SOCS1表达式。SOCS1表达增加子宫内膜的RIF的病人。在2021年最近的一项研究,减少生活和p-STAT3 RIF患者检测蛋白质含量,这可能代表了成功的胚胎植入这个途径的关键作用。SOCS1之间的负相关和miR-30d-5p提到研究已经证明。水平降低miR-30d RIF组减少STAT3和木菠萝的磷酸化,SOCS1显著增加,代表miR-30d SOCS1基因是目标,参与胚胎着床(赵et al ., 2021)。减少抑制血管生成的生活/ JAK / STAT3通路可以补偿miR-30d upregulation。miR-30d angio-miRs之一,促进血管生成通过MYPT1 / c-JUN / VEGFA通路(林et al ., 2017)。

VEGF embryo-endometrium互惠的相互作用是一个重要的元素。VEGF促进血管化和提高胚泡粘附,植入,和增长能力。此外,子宫内膜血管生成刺激的胚胎通过活动VEGF-A的生产,可以诱导血管形成和顺向胎盘发展。它已经表明,VEGF-A基因突变导致胚胎损失和胎盘发育障碍,和其他发育异常(Carmeliet et al ., 1996;费拉拉et al ., 1996;Kapiteijn et al ., 2006;郭et al ., 2021)。VEGF基因多态性与RIF的风险增加(荣格et al ., 2016;垫片et al ., 2018)。也被报道,VEGF表达明显减少了RIF的女性(汉南区et al ., 2011;睫毛et al ., 2012)。因此,多血管受损的子宫内膜组与不明原因subfertility在卵泡期的中后期已经证明(Raine-Fenning et al ., 2004)。这种血液灌注减少可能导致病理性缺氧,影响不孕患者子宫内膜接受。然而,2% - -5%氧浓度在胚胎发展的初始步骤被称为生理缺氧,并没有生命危险。

低氧诱导因子1 (HIF-1)是在组织与低氧浓度和充当hypoxia-sensitive转录因子。HIF-1修改是调节细胞适应低氧条件即使在基本水平的生理组织缺氧(Moeinabadi-Bidgoli et al ., 2021)。此外正常的胚胎发育,发生在生理缺氧环境中,HIF-1也提高了胚胎的存活率病理性缺氧环境(Dunwoodie 2009)。此外,子宫内膜HIF-1α表达式是调节RIF女性,可能由于缺氧微环境在这些患者的子宫内膜(徐et al ., 2011;陈et al ., 2016)。这个超表达可能促进局部血管生成来克服低氧诱导的后果。研究表明,血管化在植入网站推广HIF-1α表达式通过诱导VEGF基因表达(郭et al ., 2021)。最终,无误implantation-related信号通路的功能似乎必不可少的一个成功的怀孕。

2.5使用miR-30d治疗胚胎植入的失败

2019年,(官员et al ., 2019)表明,miR-30d缺乏消极影响子宫内膜接受和胎儿生长。mRNA水平有显著差异的接受标记如COX2、制药业、MSX1 MSX2,雌激素和孕激素,在植入的早期阶段miR-30d缺陷小鼠与野生型相比(WT)。miR-30d缺乏在WOI降低粘附分子的表达囊胚如整合素β3、整合素,级别alpha - 7和cadherin-5随后损害胚胎植入。此外,障碍的孕产妇miR-30d转移到胚胎着床率下降。miR-30d的缺失也导致胎儿和胎盘发育障碍。他们表明,预处理miR-30d淘汰(KO)胚胎miR-30d类似物恢复受损的植入WT和KO组(官员et al ., 2019)。同时,瞬变miR-30d转染在体外积极培养人类子宫内膜上皮细胞(hEECs)激活与生殖系统的功能相关的基因(Moreno-Moya et al ., 2014)。所以,使用miR-30d似乎有助于提高植入的结果。miR-30d可以转移通过液达到植入微环境(梁et al ., 2017)。

2.6液作为传输工具

如前所述,细胞外囊泡(EVs)参与生殖过程,包括移植和胚胎发育。液小电动汽车中发现子宫液和胚胎培养媒介(Andronico et al ., 2019)。事实上,有一个双向embryo-maternal沟通通过这些液分泌,即子宫内膜细胞和胚胎吸收彼此的液(图1)。与此同时,据报道,子宫内膜液是强烈从事促进胚胎植入的优化条件。(他et al ., 2018)表明,EVs来自子宫内膜间质细胞(EV-endMSCs)胚胎总细胞数的积极影响,开发和孵化(他et al ., 2018)。如前所述,EV microrna植入过程的监管机构是必不可少的。事实上,液转移microrna运载工具(Andronico et al ., 2019)。由于液囊的大小容量有限,混合动力液用于负载较大的质粒在最近的一项研究(林et al ., 2018)。之后,这些杂交液能够携带CRISPR / dCas9作为一个潜在的选择调节miR-30d表达式(林et al ., 2018)。

2.7目标基因超表达通过CRISPR / dCas9;使用exosome-liposome混合纳米颗粒

miR-30d基因的激活通过CRISPR / dCas9可以被认为是一种治疗植入损伤。Nuclease-deactivated Cas9 (dCas9)可用于细胞重新编程,如激活沉默内源性基因或特定基因的表达和抑制。自从dCas9核酸内切酶活性抑制,它是一种有效的基因编辑工具激活或抑制基因表达而不破坏DNA。CRISPR / dCas9可以是一个更强大的催化剂通过融合dCas9蛋白四聚物的VP16使混合蛋白质称为dCas9-VP64 (查韦斯et al ., 2015)。这种混合的组合需要一个合适的传输系统。有许多有针对性的基因传递系统,包括病毒、脂质体,membrane-derived囊泡液等。为了避免触发免疫原性反应液将管理。交付CRISPR / dCas9 exosome-liposome混合纳米颗粒是一种有效的方式将大型质粒DNA和克服液的体积小(林et al ., 2018;Nazerian et al ., 2021)。

3战略

我们建议hypoxia-sensitive miR-30d表达的调节通过trophoblast-specific dCas-9交付工程液可以提高附着力,入侵和血管生成,从而导致改进的植入和绕过孕期胎盘不足。这一战略包括三个部分:

(1)可以利用miR-30d作为上游转录组胚胎植入前胚胎的监管机构,导致超表达特定的编码基因参与胚胎粘附,入侵和血管生成。Upregulation涉及某些植入的分子,包括VEGF、子宫内膜雌激素/孕激素受体,制药业,粘附蛋白如ITGA7 ITGB3, CDH5与cox - 2酶生产是由miR-30d (Vilella et al ., 2015;官员et al ., 2019;Kolanska et al ., 2021)。此外,研究表明,miR-30d缺乏在偏见导致子宫内膜接受能力和胎儿发育障碍(官员et al ., 2019)。

(2)有可能进入停用CRISPR / dCas9 miR-30d基因激活为滋养层。除了成本较低,利用dCas9基因进入滋养层是单导RNA (sgRNA)的存在,这使得miR-30d基因活化明确目标。此外,dCas9比其他基因活化的方法,包括药物,由于其稳定性在孕期滋养层和基因表达调控的可能性通过监管促进剂(Brezgin et al ., 2019)。为了防止dCas9有害过度活跃,我们可以利用监管促进剂包含hypoxia-response元素(人力资源)结合位点低氧诱导因子1 (HIF-1),位于上游dCas9 (2017年爪哇和Shahbazi;Shakirova et al ., 2020)(图2)。因此,之前和期间植入胎盘机能不全的条件,miR-30d表达增加,并将缺氧消除后熄灭。

(3)基因治疗是一种理想的向量,一个质粒向量包含“脚手架/矩阵附件地区(S / MAR)”领域能够持续表达活动相比,更少的安全问题与其他慢病毒载体等常见的向量。病毒性S / MAR向量可以复制游离extra-chromosomal实体有针对性的滋养层(黄et al ., 2011;Bozza et al ., 2020)。在各种dCas9交付运营商,液的优点是其低免疫原性(Samanta et al ., 2018)。然而,由于外来体大小的限制,建议利用exosome-liposome混合动力车作为承运人(Biagioni et al ., 2018)。所示图2,这些杂交液配有ErbB-4配体表面只为了进入滋养层层没有感染内细胞团。

图2

图2。研究设计。(一)间充质干细胞的隔离和表征液超离心机(MSC液)的方法。(B)表面抗体ErbB4共轭建设性的脂质体。(C)液源自end-MSCs将孵化靶向脂质体exosome-liposome混合动力车。(D)病毒性S / MAR游离向量构造包含:sgRNA, HIF-1敏感催化剂(证据),dca 9日VP64, GFP基因序列、强力霉素敏感的基因,和核糖体跳过2基因之间的序列。(E)电穿孔将用于封装设计游离S / MAR向量混合。(F)liposome-exosome混合动力车将被添加到媒体滋养层细胞和游离向量将专门进入滋养层。

4评价策略

为了评估拟议的战略调整miR30-d表达式通过trophoblast-specific dCas9交付,在体外和在活的有机体内实验研究也将进行。首先,在在体外节中,一个包含dCas9游离向量和补充sgRNA miR-30d基因的设计包含在一个特定exosome-liposome混合动力车。这种混合载体应该穿着trophoblast-specific抗体在其表面。其次,该混合载体将特别使转染小鼠囊胚的滋养层细胞,从试管受精以前完成。最后,这个胚泡的着床率将被评估在体外。在在活的有机体内节中,这些转染囊胚将转移到雌性小鼠子宫、和植入率将被评估在活的有机体内(图2)。

4.1在体外研究

以下4.4.1外来体子宫内膜间充质干细胞的提取

子宫内膜间质干细胞(endMSCs)可以从健康女性的经血(分离莫雷诺et al ., 2017)。由外来体提取液从endMSCs绝缘介质和进一步离心(他et al ., 2018)。

4.1.2 Trophoblast-targeted脂质体设计

脂质体被广泛用于基因和药物输送的目的。Lipoplexes源于阳离子脂质体一般具有高货物交付功效在体外与多个影响并形成multilamellar结构,CRISPR / dCas9都包含在脂质影响(甄和李,2020年)。它已经证明了非特异性离子相互作用的脂质体/ lipoplexes阳离子与阴离子表面脂质细胞膜表面和蛋白聚糖有助于细胞吸收过程(Zhang et al ., 2004;甄和李,2020年)。此外,ErbB4靶向配体附着在脂质体表面进一步提高细胞吸收以及特有的基因传递(保罗et al ., 2017)。表面功能化的脂质体通过附加目标配体的外脂质层可以使一个靶向脂质体(Riaz et al ., 2018)。因此,构建脂质体后,抗体ErbB4,滋养层的特定的表面蛋白,将这些脂质体表面共轭(Chobotova et al ., 2002)。解决生产阳离子lipoplexes在先前的研究中详细描述等Junquera和Aicart (2016)。

4.1.3 Liposome-exosome混合生产

液是小型膜囊泡,可以携带不同的分子。由于其体积小,混合动力液的针对性和有效的交付承诺运营商所需的分子(林et al ., 2018)。为了使混合动力液,液来自endMSCs将surface-targeted脂质体在37度孵育12 h,如图所示林et al。(2018)。在这项研究中,我们建议孵化路线由于其简单性和有效性在保护外来体和脂质体膜。在那之后,我们的质粒向量可以封装到这个混合。脂质体的融合和液将证实了动态光散射(DLS)大小分布加上电动电势(ZP)分析。杂交液的水动力直径的DLS措施Stokes-Einstein方程。除了大,混合动力液通常拥有略减少ZP脂质体相比,由于最初的负电荷液(保护好,2016)。以下exosomal融合的图像将显示确认(保护好,2016;刘et al ., 2022)。流式细胞术和免疫印迹分析将进一步确认anti-ErbB4表面配体的存在liposome-exosome混合提取物(林et al ., 2018;Alghuthaymi et al ., 2021)。同时,ErbB4抗体在脂质体的表面拓扑将取决于计算合并比率作为post-inserted脂质体所描述的李et al。(2016)。

因为我们的混合动力液被运送到了滋养层膜在体外,不需要表面PEGylation关于增加循环稳定;特别是由于细胞吸收和减少endosomal PEGylation后逃跑率。

4.1.4游离向量liposome-exosome混合设计和交付

S /火星at富集结合染色质的DNA序列核矩阵(Stavrou et al ., 2019)。S / MAR向量是non-integrating病毒性游离向量与低免疫原性(黄et al ., 2011)。所示图2,病毒性S / MAR游离向量包含sgRNA, HIF-1敏感的启动子,dca 9日VP64, GFP基因序列、强力霉素敏感的基因,和核糖体跳过2基因之间的序列(谢et al ., 2017)。为了封装设计游离S / MAR矢量混合载体,将进行电穿孔(Bunggulawa et al ., 2018)。

4.1.5体外受精过程

卵母细胞的女性快速公车提供小鼠模型将由管理获得刺激排卵后孕马血清促性腺激素。48小时后,人体绒毛膜促性腺激素(hCG)将在适当的管理和存储媒体。雄鼠的精子将收集到的附睾,精子获能和成熟后,将被添加到卵母细胞受精。在其发展过程中,受精卵将进一步形成滋养层,内细胞团层(官员et al ., 2019)。

4.1.6游离向量转换为滋养层细胞

为了提供专门为滋养层细胞的基因,liposome-exosome混合动力车与trophoblast-specific抗体表面将被添加到媒体滋养层细胞。通过附加anti-ErbB4抗体表面的混合载体ErbB4蛋白在滋养层表面,游离向量将进入滋养层。此外,滋养层覆盖层内细胞团和有保护作用对外国分子或细胞组件,包括液(Georgiades et al ., 2007)。此外,免疫印迹分析和荧光成像将用于跟踪GFP蛋白表达确认所需的向量的具体传导的滋养层细胞(冈田克也et al ., 2007)。

4.1.7 miR-30d表达转染囊胚的测量

转染后的胚泡,这个交付系统的效率和miR-30d表达水平将评估rt - pcr方法。

4.1.8评价的影响miR-30d过度植入率

两组需要评估的影响mir-30d过度植入。从试管受精过程正常囊胚获得没有任何基因操作将培养endMSC-derived液在第一组。第二组将由囊胚的转染游离向量在受精卵的阶段,在相同条件下培养的第一组。在胚胎的数量相比,两组将前后摇晃旋转瓶评估植入率。

为了确定植入的分子水平上的变化,在胚胎与子宫内膜细胞分离,CDH5水平,ITGB3, ITGA7蛋白质和基因表达在胚胎将由免疫印迹分析和评估RT-qPCR,分别。此外,免疫印迹分析和RT-qPCR将评估生活水平,VEGF, COX2蛋白和基因表达在子宫内膜细胞,分别为(Vilella et al ., 2015)。

4.2在活的有机体内研究

五组将被视为评估有效性的增强miR-30d表情植入:1 -第一组由雌性老鼠交配的雄性老鼠和会怀孕。2 -第二组由vasectomized雄性雌性老鼠住的。3 -第三组由雌性老鼠接受体外受精胚泡的过程没有任何基因操作。4 -第四组由雌性老鼠接受试管受精过程,孵化的胚泡liposome-exosome混合动力车缺乏游离向量。5 -最后一批由雌性老鼠接受体外受精胚泡的过程被trophoblast-specific转基因基因传递如前面所讨论的。4天前胚胎移植(ET),第三,第四,第五小组,雌性老鼠将安置vasectomized男性成为pseudopregnant,这对怀孕是必要的。然后将执行等非手术胚胎移植的方法。

4.2.1 dCas9基因的影响评估准备交付的在活的有机体内表达miR-30d

输卵管的老鼠每组6将解剖在天,12日和16的怀孕。然后,RT-qPCR方法将评估miR30d滋养层细胞中的表达水平。此外,确认具体的基因传递到滋养层层内细胞群层中,而不是将显示通过跟踪GFP荧光显微成像。

4.2.2在活的有机体内评估增加的植入miR-30d表达式

天6、12和16的怀孕,静脉注射后植入网站统计芝加哥天空蓝色的解决方案。此外,天6、12和16个怀孕的,老鼠将会牺牲,子宫和胎盘会被孤立,子宫和胎盘的生活水平,VEGF,整合素级别alpha - 7,整合素β3,和COX2蛋白和基因水平评估通过免疫印迹和RT-qPCR技术,分别。胎儿生长受限及胎盘机能不全将评估通过测量crown-rump长度(CRL),胚胎的重量,和胎盘的重量在怀孕12和16天。

5讨论和未来方向

植入失败是主要限制在艺术过程和主要源于受损的子宫内膜接受(Franasiak et al ., 2014;Craciunas et al ., 2019)。改善子宫内膜接受导致增强胚胎粘附,入侵和血管生成胚胎植入的关键步骤。考虑到miR-30d的至关重要的作用在调节子宫内膜接受通过激活相关信号通路如生活/ gp130 / STAT和upregulation VEGF,我们提出miR-30d upregulation将协助囊胚植入。此外,miR-30d将改善胎儿的生存来响应低氧浓度在怀孕期间。在低氧条件下,低氧诱导因子转录系统被激活并帮助胚胎生存的低氧环境。HIF-1α主要是与缺氧条件(Dunwoodie 2009)。因此,控制增加miR-30d hypoxia-sensitive的方式回应HIF-1αupregulation建议在这个研究。

先前的研究已经证明,microrna的表达模式改变在女性月经周期的每个阶段,也在肥沃的女性与RIF患者相比差异表达(用et al ., 2018;冯Grothusen et al ., 2022)。同时,miR-30d表达水平经历了最重大的变化相对于其他小分子核糖核酸WOI期间,指示miR-30d在胚胎植入的潜在关键作用(Kuokkanen et al ., 2010;Vilella et al ., 2015)。子宫内膜分泌miR-30d吸收滋养外胚层细胞修改胚胎植入前胚胎的基因表达(Altmae et al ., 2013;Moreno-Moya et al ., 2014;Vilella et al ., 2015)。其中一个基因的修改是通过抑制MYPT1诱导VEGF表达和激活LIF-induced STAT3通路,促进子宫内膜血管生成。MiR-30d促进激活LIF-induced STAT3通路,可能通过表达下调SOCS1在胚胎和子宫内膜(林et al ., 2017;赵et al ., 2021)。广泛受损血管生成由于降低VEGF水平在RIF发现患者(汉南区et al ., 2011;睫毛et al ., 2012)。Endometrium-derived embryo-derived VEGF参与子宫内膜血管生成,增加植入成功,胎盘的发展。除了血管生成,LIF-induced途径促进粘附和入侵诱导整合蛋白分别表达和基质金属蛋白酶(阿尔夫et al ., 2017;郭et al ., 2021;赵et al ., 2021)。因此,激活JAK /生活/ STAT3通路促进血管生成,诱导VEGF表达,滋养层细胞的侵袭性基质金属蛋白酶的激活转录,通过增加整合蛋白的表达和附着力。总之,调节miR-30d表达式是认为便于植入过程RIF病人提高附着力,入侵和血管生成。

也有报道的miR-30d upregulation影响人类子宫内膜内皮细胞(hEECs)和小鼠模型,导致reproduction-related基因的激活和改善移植结果(Moreno-Moya et al ., 2014;Vilella et al ., 2015)。此外,(官员et al ., 2019)评估的影响miR-30d缺乏子宫内膜接受和公布miR-30d植入成功率明显降低报废小鼠模型相对于野生型和miR-30d-treated (官员et al ., 2019)。因此,miR-30d upregulation似乎必须成功怀孕,尽管先前的研究结果仅限于植入阶段和没有控制的方式。在我们提出策略,miR-30d表达式是通过反馈机制缺氧后压力和持续监管提出了更多控制的结果。除了改进植入,猜测策略艾滋病在怀孕晚期胎盘机能不全。

为了控制miR-30d表达式,一个游离向量包含主要CRISPR / dCas9和miR-30d发起人sgRNA建议在这个研究。利用CRISPR / dCas9代替CRISPR / Cas9基因传递由于破坏宿主DNA dCas9无能,可以大大减少的风险破坏胚胎的DNA。胚胎的遗传操作已经完成在几个先前的研究使用直接熔池CRISPR / ca和sgRNA产生突变的老鼠(官员et al ., 2019)。然而,他们的研究的CRISPR / dcas9交付方法不同于我们,但他们证明有效的基因编辑在胚胎成功怀孕。另一个研究(践踏et al ., 2018)报道成功的基因组编辑通过输入CRISPR / Cas小鼠受精卵通过电穿孔(践踏et al ., 2018)。不管CRISPR / Cas交付方法的变化在先前的研究中,使用CRISPR / Cas在基因编辑导致理想的转基因婴儿。然而,不受控制的表达式miR-30d可能令人担忧的母亲和胎儿的健康。因此,监管促进剂包含hypoxia-response元素(人力资源)是用来结合位点低氧诱导因子1 (HIF-1)控制miR-30d基因表达没有缺氧的压力。此外,强力霉素敏感性基因将被插入到设计向量函数作为开关如果需要。这一战略的风险最小化无意miR-30d超表达。

至于向量交付,liposome-exosome混合可以传输较大的核酸片段相比普通液(林et al ., 2018;段et al ., 2021)。脂质体的组成部分,阳离子lipoplexes足够胜任CRISPR交付由于增强封装通过静电吸引带负电荷的核酸。此外,阳离子脂质体有更好的机会进入滋养层膜通过互动与阴离子表面脂质和蛋白聚糖(甄和李,2020年;Nsairat et al ., 2022)。的脂质体lipoplexes的阳离子脂质形成离子键与endosomal阴离子膜,最终导致lipoplex拆卸和脂质体的释放CRISPR内容到细胞质(齐米Oskuee et al ., 2016)。对于安全的基因传递,我们将装备Erb-B4靶向配体的脂质体表面精确瞄准滋养层细胞的表面克服感染的担忧内细胞团(竹内et al ., 2017;木头et al ., 2021)。从好的方面说,周围的滋养外胚层层防止通过大分子和细胞粒子,包括液,内细胞团(Hemberger et al ., 2020)。靶向治疗的miR-30d超表达提供了相当大的优势,包括独家基因传递滋养层细胞,抑制干扰的影响胚泡的基因操纵,和更少的混合接种液。

最后,miR-30d可以用作治疗选择增加胚胎植入成功。这项研究提供了一个基于转移的治疗策略hypoxia-sensitive游离向量通过使用转基因杂交液trophoblast-specific dCas9交付。在病理性缺氧条件下,miR-30d表达式会增加由于绑定HIF-1α人力资源子。miR-30d表达升高导致增加子宫内膜接受导致增强胚胎粘附、入侵和血管生成。除了改进移植,这种策略假设会让胎儿能够幸存的病理性缺氧造成的恶劣的环境的怀孕。

据我们所知,没有先前的研究管理hypoxia-sensitive miR-30d监管通过HIF-1α表达,提高移植成功率。因此,它是至关重要的在即将到来的艺术研究中调查这种治疗策略。

数据可用性声明

最初的贡献提出了研究中都包含在本文/辅料,可以针对相应的作者进一步询问。

作者的贡献

唉,YN, AA, HN: conseptualization。是的,YN,我和AA:调查。是的,YN,我和AA:原创作品准备草案。唉,YN, AA,和一个:writing-review和编辑。一个:图形设计。HN:监督。所有作者阅读并同意提交版本的手稿。

资金

这项工作是由校长在研究事务,Shahid Beheshti医疗,德黑兰,伊朗和研究资助委员会从美国国立医学研究发展(NIMAD),德黑兰,伊朗,在格兰特的963951。

确认

我们想表达我们最诚挚的感谢Tahereh Tayebi宝贵的贡献。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

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引用

阿尔夫,J。,Happel, L., Dittrich, R., Beckmann, M. W., Hartmann, A., Gaumann, A., et al. (2017). Insufficient angiogenesis: Cause of abnormally thin endometrium in subfertile patients?Geburtshilfe Frauenheilkd。77 (07),756 - 764。doi: 10.1055 / s - 0043 - 111899