原始研究的文章

前面。细胞Dev。杂志。,12January 2023
秒,细胞粘附和迁移
卷10 - 2022 | https://doi.org/10.3389/fcell.2022.1064907

Celsr1和Celsr2展览不同的胶粘剂为平面细胞极性相互作用和贡献

莉娜p Basta ¹ ^__, www.雷竞技rebatfrontiersin.org

Parijat银¹ ^__,

丽贝卡·a·琼斯 ¹, www.雷竞技rebatfrontiersin.org

凯瑟琳·a·小¹,

加芙Hayward-Lara ^1、2和

Danelle Devenport ¹*

¹分子生物学、普林斯顿大学,普林斯顿,新泽西,美国
²目前的关系。美国宾夕法尼亚大学,费城,宾夕法尼亚州

钙粘着蛋白EGF滞后seven-pass g字受体(Celsr)蛋白1 - 3组成一个小组的粘附GPCRs函数从平面细胞极性(PCP)信号到轴突寻路和ciliogenesis。喜欢它的果蝇直接同源,火烈鸟,哺乳动物Celsr1卡式肺囊虫肺炎通路的核心组成部分,而其他角色,负责协调整个皮肤表面对齐的毛囊。虽然Celsr1的角色在表皮平面极性建立,其他主要的贡献表达表皮Celsr蛋白质,Celsr2,没有调查。这里,使用两个新的CRISPR / Cas9-targeted Celsr1和Celsr2淘汰赛鼠标线,我们定义的相对贡献Celsr1和Celsr2卡式肺囊虫肺炎建立在皮肤上。我们发现Celsr1 Celsr主要家庭成员参与表皮卡式肺囊虫肺炎。删除Celsr1函数仅破坏卡式肺囊虫肺炎蛋白质不对称和毛囊极化,而表皮卡式肺囊虫肺炎是受Celsr2损失的影响。此外,消除Celsr蛋白质只有最低限度的提高Celsr1^−−/表现型。使用收紧和交叉的浓缩试验测量的差异Celsr1 Celsr2胶粘剂的相互作用,我们发现Celsr1相比,在联接的接口,稳定丰富Celsr2更有效地招募和固定连接。作为两种蛋白质似乎等效的能力与核心交互卡式肺囊虫肺炎蛋白质Vangl2 Fz6,我们建议亲同种抗原的粘连导致的差异也许微分Celsr1和Celsr2表皮卡式肺囊虫肺炎。

介绍

钙粘着蛋白EGF滞后seven-pass g字受体(Celsr)是典型的钙粘着蛋白组成的子群粘附蛋白结合受体(GPCRs) (Langenhan et al ., 2013;Krishnan et al ., 2016)。他们的大型ectodomains组成的氨基端钙粘蛋白重复参与亲同种抗原的附着力(王et al ., 2014;Goffinet迪西尔,2017)。脊椎动物有3 Celsr基因,Celsr1-3,直向同源果蝇火烈鸟(又名星夜Fmi;斯坦),最出名的是它的功能在平面细胞极性(PCP),分子途径通过细胞极性协调一致以及上皮平面(Boutin et al ., 2012;迪西尔Goffinet, 2013;Goffinet迪西尔,2017)。Celsr在脊椎动物胚胎发育的关键基因及其功能从上皮平面细胞极性的建立到神经寻路和ciliogenesis (冯et al ., 2012;迪西尔Goffinet, 2013;Goffinet迪西尔,2017)。突变小鼠Celsr1例如,引起严重的神经管缺陷关闭(科廷et al ., 2003),Celsr2突变导致能动的纤毛的形成导致致命缺陷脑积水(迪西尔et al ., 2010)。在人类中,几个Celsr1变异与神经管缺陷已确定,暗示这些蛋白质在人类发展和疾病(Allache et al ., 2012;罗宾逊et al ., 2012;Lei et al ., 2014;乔et al ., 2016)。的扩张Celsr亚科在脊椎动物可能已经允许每个同族体进化出不同的功能,但是Celsr蛋白质的重叠和独特的功能只是部分。此外,分子的细节Celsr缺乏监管和功能。

Celsr1-3非常大(> 300 kd)蛋白质组成的九个细胞外钙粘蛋白重复,一系列的EGF和LamG重复,激素受体域(HormD),一个GPCR autoproteolysis-inducing(获得)域其次是七个跨膜螺旋和一个相对较长的(∼300 - 600 aa)胞质尾(图1一个)(王et al ., 2014;Goffinet迪西尔,2017)。尽管他们域组织相似,鼠标Celsr1-3分享只有∼35%氨基酸的身份。Celsr1-3成绩单广泛表达于神经系统和上皮细胞器官和存在重叠和组织表达模式(Formstone和小,2001年;日本岛et al ., 2002;迪西尔et al ., 2002)。Celsr1和Celsr2表达重叠在许多胚胎组织包括大脑、肾脏、肺、和嗅觉上皮,而Celsr3主要是神经系统(日本岛et al ., 2002;迪西尔et al ., 2002)。功能,Celsr1对卡式肺囊虫肺炎是至关重要的建立在几个鼠标上皮组织和被认为是一个“核心”卡式肺囊虫肺炎组件(科廷et al ., 2003;Devenport和福克斯,2008;Ravni et al ., 2009;Boutin et al ., 2014;施et al ., 2014;Stahley et al ., 2021)。相比之下,Celsr2和Celsr3功能研究主要集中在神经系统有多个角色在轴突寻路和大脑连接(日本岛et al ., 2004;迪西尔et al ., 2005;日本岛et al ., 2007;周et al ., 2008;瞿et al ., 2010;Boutin et al ., 2012;柴et al ., 2014;瞿et al ., 2014)。Celsr2和Celsr3也参与生物起源和平面偏振的能动的纤毛室管膜细胞(迪西尔et al ., 2010;Boutin et al ., 2014),但目前尚不清楚Celsr2 Celsr3功能更广泛的核心脑室外卡式肺囊虫肺炎通路。在某些情况下,比如在纤毛生物起源和轴突延伸,Celsr2和Celsr3部分冗余(瞿et al ., 2010;迪西尔et al ., 2010;瞿et al ., 2014),而在其他情况下,他们的功能是反对(日本岛et al ., 2007)。然而,目前还不清楚到什么程度Celsr2或3行动多余地Celsr1卡式肺囊虫肺炎。

图1

图1。代Celsr1和Celsr2突变老鼠CRISPR / Cas9损失函数。(一)Celsr1和Celsr2蛋白质域的示意图表示。两个相同的氨基酸序列和蛋白质55%有相同的域组织整体。(B)CRISPR-Cas9瞄准的Celsr1和Celsr2基因位点。指导rna是针对序列编码的信号肽Celsr1和Celsr2。结果有针对性的等位基因显示与ATG信号序列用紫色字体和删除序列用黄色突出显示。(C)Celsr1^−−/和野生型(WT在P12)同窝出生仔畜。注意头发卷曲的尾巴,轮生的模式的头Celsr1^−−/纯合子。(D)左和右的爪子Celsr1^−−/和WT同窝出生仔畜P12。Celsr1^−−/该展览突出头发螺纹在每个爪子。(E)Celsr1^−−/和WT同窝出生仔畜E15.5胚胎。Celsr1^−−/该显示卷曲的尾巴。(F)从WT和免疫印迹的表皮溶解产物Celsr1^−−/P0-P3 backskins anti-Celsr1抗体。(G)免疫印迹的表皮溶解产物从三个人WT和两个人Celsr2^−−/P0-P3幼崽anti-Celsr2抗体。(H)整个山的共聚焦免疫荧光图像从E15.5表皮WT和Celsr1^−−/突变体胚胎贴上Celsr1抗体。规模的酒吧:10µm。(我)量化的Celsr1平均荧光强度WT和Celsr1^−−/突变体表皮(n = 3 4种不同的皮肤区域WT胚胎和n = 3的皮肤从三个不同的区域Celsr1^−−/胚胎)。

尽管他们重要的角色在胚胎形态发生和神经系统的形成,Celsr函数的分子细节仍然知之甚少。聚合实验non-adherent cadherin-free细胞系(果蝇S2, A431D和/或K562细胞)已经证明,所有三个Celsr蛋白质调节亲同种抗原的附着力通过他们的c端钙粘蛋白重复(日本岛et al ., 2004;日本岛et al ., 2007;Stahley et al ., 2021)。Celsr2和Celsr3钙粘蛋白重复激活Celsr-mediated反应神经元,并亲同种抗原的Celsr1粘附支持稳定联接的招聘和卡式肺囊虫肺炎复杂组织(日本岛et al ., 2007;Stahley et al ., 2021)。Celsr1研究表明,就像经典钙粘蛋白,Celsr钙粘蛋白重复域包含绑定网站trans-adhesive和cis-clustering交互(Stahley et al ., 2021)。调解粘附的能力,似乎是其功能的关键,很多关于Celsr蛋白质的分子相互作用仍然是未知的。此外,胶的差异不同Celsr蛋白质之间的相互作用没有严格测试。

鼠标表皮被破译的理想模型的相对贡献Celsr蛋白质卡式肺囊虫肺炎。在皮肤上,卡式肺囊虫肺炎通路管理的极化和对齐身体毛发在皮肤表面(郭et al ., 2004;Devenport和福克斯,2008;Ravni et al ., 2009)。核心卡式肺囊虫肺炎的蛋白质,包括Celsr1表皮基底细胞表达,这是产生祖细胞外皮肤层和毛囊(Devenport和福克斯,2008;Basta et al ., 2021)。Celsr1定位不对称连接的基底细胞,它形式同型的胶粘剂前部和后部的邻居之间的交互(Devenport和福克斯,2008;Stahley et al ., 2021)。Celsr1身体与其他跨膜卡式肺囊虫肺炎组件交互,Fz6 Vangl2,并促进他们的组装成异形的,细胞间复合物(Devenport和福克斯,2008;Stahley et al ., 2021)。目前的大部分了解Celsr1来自的研究崩溃突变体(Celsr1^Crsh),它显示严重PCP-related包括神经管缺陷关闭失败,使定向变异静纤毛在耳朵和偏差毛囊在皮肤的表面(科廷et al ., 2003;Devenport和福克斯,2008)。的崩溃变异映射到一个氨基酸替换(D1040G) ectodomain破坏Celsr1形成稳定的能力,集群组件通过横向独联体相互作用(科廷et al ., 2003;Stahley et al ., 2021)。因此,Celsr1不对称定位和毛囊极性干扰(Devenport和福克斯,2008;Stahley et al ., 2021)。然而,D1040G突变不降低整体Celsr1蛋白质含量或其膜浓缩,也不干扰Fz6或Vangl2协会(Stahley et al ., 2021)。因此,尽管它semidominant效果,崩溃hypomorphic等位基因,会损害一些但不是全部Celsr1功能。完全丧失Celsr1功能如何影响表皮卡式肺囊虫肺炎建立尚未详细探讨。

与Celsr1相比,Celsr2的角色和Celsr3表皮卡式肺囊虫肺炎和其他皮肤功能在很大程度上仍未知。而Celsr2表达在皮肤上皮在胚胎和产后阶段,Celsr3成绩单不检测(日本岛et al ., 2002;Sennett et al ., 2015)。出于这个原因,我们决定删除所有的后果Celsr皮肤功能通过生成新的CRISPR / Cas9-inducedCelsr1,Celsr2,和Celsr1 2基因敲除小鼠的两倍。特别关注建立表皮在单引号和双卡式肺囊虫肺炎Celsr丧失突变体,我们发现Celsr1是主要Celsr家庭成员参与表皮卡式肺囊虫肺炎。Celsr1去除破坏卡式肺囊虫肺炎蛋白质不对称和毛囊,极化,一个戏剧性的表型是最严重的表皮卡式肺囊虫肺炎缺陷之前报道(等等et al ., 2017)。相比之下,非对称的本地化卡式肺囊虫肺炎蛋白质和毛囊对齐大多仅Celsr2损失的影响,和删除两Celsr蛋白质只有最低限度提高Celsr1表型。获得洞察Celsr1之间的差异和Celsr2粘合剂相互作用,我们进行了一系列交叉的招聘和培养的角质细胞,收紧化验发现而Celsr1强烈和稳定丰富的联接的接口通过亲同种抗原的胶粘剂交互,Celsr2更有效地招募到结更多的移动和扩散。heterotypically交互的两个Celsr蛋白质能够在反式和类似的能力招募Fz6 Vangl2连接。总之,这些数据表明,Celsr1和Celsr2显示关键差异形成稳定的能力,胶组件,可能构成,在某种程度上,他们在老鼠胚胎发育不同的函数。

结果

代Celsr1和Celsr2基因敲除小鼠使用CRISPR / Cas9基因打靶

生成删除突变Celsr1和Celsr2基因,我们使用传统CRISPR / Cas9基因打靶的方法诱导的双链断裂和indelsCelsr1和Celsr2基因位点。指导rna是为了目标Cas9基因组区域编码转化开始网站和信号序列的每个Celsr基因(图1 a, B;补充图S1)。我们推断,这个策略,即使另一个起始密码子存在,删除的信号序列应该防止co-translational插入蛋白质在内质网和导致非功能性蛋白质产品。经过筛选和排序不同的突变,经历了种系传播,两个等位基因被选为传播和backcrossed建立杂合的鼠标线。Celsr1^{< em1Ddev >}港口81碱基对的缺失,包括翻译网站开始,第一个17 29氨基酸的密码子信号序列(图1 b;补充图S1)。Celsr2^{< em1Ddev >}还怀有这样一种81碱基对缺失,包括起始密码子和第一个9信号序列的密码子(图1 b;补充图S1)。

Celsr1^{< em1Ddev > / < em1Ddev >}比如(称为Celsr1^−−/以后)恢复在孟德尔比率却越来越弱于其杂合的和野生的同胞。这些动物也显示卷曲的尾巴,头摇的行为和轮生的头发模式变量外显率(图1 c, D)。纯合子的Celsr1^−−/胚胎显示卷曲的尾巴(图1 e),有时,神经管缺陷。这些表型类似报道不同Celsr1零变异和符合缺陷的卡式肺囊虫肺炎通路Celsr1已知函数(Ravni et al ., 2009)。纯合子的Celsr2^{< em1Ddev >}动物(称为变异Celsr2^−−/以下)都是可行的和肥沃的出生时没有显示任何明显的形态缺陷。然而,许多发达产后脑积水(没有显示),也符合之前的报道不同的Celsr2等位基因(迪西尔et al ., 2010)。

用西方的屁股Celsr1我们检测到抗体∼300 kd蛋白带表皮溶解产物从野生型胚胎准备(图1 f)。这个乐队是强烈的溶解产物减少Celsr1^−−/表皮暗示Celsr1蛋白质不能被翻译或退化。然而,我们的检测能力甚至野生型Celsr1通过免疫印迹是变量,和一个模糊的带类似规模仍可检测Celsr1^−−/溶菌产物,我们转向免疫荧光证实蛋白质减少Celsr1^−−/突变体。在E15.5野生型胚胎表皮,Celsr1表达在皮肤上皮的基底层,它不对称前后连接(图1 h)。相比之下,Celsr1免疫荧光强烈降低Celsr1^−−/胚胎(图1我)和荧光信号仍然是分散和unlocalized (图1 h),进一步表明Celsr1^−−/突变体不使产品功能的蛋白质。

西方墨迹Celsr2抗体也发现一种∼300 kd乐队从控制表皮溶解产物,并没有出现在溶菌产物从纯合子Celsr2^−−/老鼠(图1 g)。鉴于基因位点的突变表型,免疫印迹和免疫荧光数据,我们得出这样的结论:Celsr1^{< em1Ddev >}和Celsr2^{< em1Ddev >}蛋白质突变等位基因可能是null。虽然我们不能排除这种可能性,神秘的开始网站的下游Celsr1和Celsr2删除可能会产生部分蛋白质产品,我们预测这些缩氨酸缺乏一个氨基端信号序列,将针对退化。

但不是Celsr2 Celsr1,毛囊所需极化

正确的前后(p)哺乳动物毛囊定位依赖于核心卡式肺囊虫肺炎通路的功能。突变Fz6、Vangl2 Celsr1都是为了破坏毛囊的形态发生不对称和协调对齐(郭et al ., 2004;Devenport和福克斯,2008;Ravni et al ., 2009;Chang et al ., 2016;等等et al ., 2017)。然而,我们知道Celsr1函数在皮肤上来自Celsr1的考试崩溃突变点突变,破坏Celsr1不对称,但不降低整体蛋白质水平表皮细胞连接(Stahley et al ., 2021)。的Celsr1^−−/小鼠模型不同于生成崩溃突变体在没有Celsr1蛋白质检测表皮细胞连接(图1 h)允许我们确定Celsr1功能丧失的突变表型的后果。研究这个问题,我们标记E15.5 backskins P-cadherin和Sox9抗体,标记不同的人群的祖细胞放置在极化毛囊的前部或后部,分别为(图2一个)(等等et al ., 2018)。与之前报道的卵泡极性与其他Celsr1等位基因缺陷的观察,毛囊取向的Celsr1^−−/胚胎backskins遭到严重破坏。而不是沿着p轴偏振和朝前发展,大多数毛囊生长垂直向下,垂直进入真皮,明显的“车轮”像表达Sox9环围绕一个中心集群P-cadherin表达细胞(图2 b)。量化的数量和取向极化在整个backskins毛囊,我们使用一个自动分割和毛囊角计算算法,紧随其后特别的手调整(见方法)。而野生型毛囊是强劲极化和增长在前方向(图2 e、H),90%以上的毛囊Celsr1^−−/胚胎backskins未极化的和显示垂直方向增长。为数不多的Celsr1^−−/毛囊,显示PCad-Sox9不对称是面向随机相对于p轴(图2 f I)。

图2

图2。但不是Celsr2 Celsr1,毛囊正确不对称方向发展的必要条件。(一)平均强度的投影WT胚胎皮肤在E15.5,贴上P-cadherin(绿色)和Sox9(红色)。白框表示放大区域所示,离开了。一个典型的平均强度投影WT毛囊成像mag(下面,右)更高。酒吧规模:1000、200和25µm,分别。前是左边。(罪犯)至于(一),除了Celsr1^−−/,Celsr2^−−/和Celsr1^−−/;Celsr2^−−/分别。(E)条形图显示累计百分比的极化(灰色栏)和无极(白色Bar)在n = 3 E15.5背部皮肤毛囊3种不同的胚胎。n在图代表的卵泡总数进行了分析。误差= SEM。(F-H)至于(E),除了Celsr1^−−/,Celsr2^−−/和Celsr1^−−/;Celsr2^−−/分别。(我)玫瑰的极化毛囊(E)显示的角度定位,与前= 0°和后= 180°。在酒吧阴影区域代表每个复制的相对贡献(n = 3 backskins从三种不同的胚胎),n在图代表的极化毛囊总数进行了分析。(J-L)至于(我),除了Celsr1^−−/,Celsr2^−−/和Celsr1^−−/;Celsr2^−−/分别。

Celsr1相比,对Celsr2在哺乳动物表皮的作用。Celsr2信使rna表达在表皮和基板(Sennett et al ., 2015)。因此,我们接下来问Celsr2损失是否会影响毛囊Celsr1取向以类似的方式。不同于Celsr1^−−/胚胎,毛囊Celsr2^−−/胚胎显示适当的p取向和与野生型是没有区别的,这表明Celsr2是可有可无的适当的毛囊在老鼠胚胎backskin取向(图2 c、G J)。

我们接下来要求删除Celsr2是否会提高毛囊表型观察到Celsr1^−−/胚胎。为此,我们穿过Celsr1^{−/ +}和Celsr2^−−/小鼠产生纯合子,双突变体胚胎(Celsr1^−−/;Celsr2^−−/)。从E15.5 BackskinsCelsr1^−−/;Celsr2^−−/胚胎然后贴上Sox9 P-cadherin抗体和毛囊极性分析。毛囊的表型Celsr1^−−/;Celsr2^−−/胚胎是区别Celsr1^−−/进一步表示Celsr1胚胎,但不适当的毛囊需要Celsr2取向(图2 d、H K)。我们从这些数据得出Celsr1是主要核心卡式肺囊虫肺炎在表皮钙粘着蛋白功能。

Celsr1,在较小程度上,Celsr2所需不对称定位核心卡式肺囊虫肺炎的组件

毛囊偏振依赖于核心卡式肺囊虫肺炎的非对称分布在表皮基底细胞的细胞间连接蛋白(Devenport和福克斯,2008;等等et al ., 2017;等等et al ., 2018)。Celsr1本地化的前部和后部连接的每一个细胞,分别与Vangl2 colocalizes和Fz6 (Devenport和福克斯,2008;Basta et al ., 2021;Stahley et al ., 2021)。基于极性分析Celsr1的皮肤崩溃突变体胚胎,我们知道卡式肺囊虫肺炎不对称依赖于适当的Celsr1函数。的Celsr1崩溃突变鼠(Celsr1^Crsh),港口一个氨基酸替换(D1040G)扰乱Celsr1形成横向的能力独联体相互作用结果,Celsr1集群、联接的稳定和不对称都受损了Stahley et al ., 2021)。在果蝇、Fz、稳索失去了从Fmi突变体的顶端连接暗示,除了促进他们的不对称的本地化,Fmi新兵和/或稳定Fz和稳索细胞连接(斯特拉特2001;Bastock et al ., 2003;陈et al ., 2008)。是否Celsr未知蛋白在哺乳动物中执行类似的功能是在丧失突变体尚未经过测试。

测试是否Celsr1和Celsr2所需核心卡式肺囊虫肺炎的招聘和/或极化组件,我们测量方向和大小(Celsr1向列顺序),Fz6和Vangl2不对称细胞连接。要做到这一点,我们拍摄整个山E15.5 backskins贴上抗体Celsr1, Vangl2 Fz6。使用钙粘蛋白或执行自动分割的上皮边缘P-Cadherin交界标记(Aigouy et al ., 2016)。卡式肺囊虫肺炎的向列顺序蛋白质荧光强度测量使用QuantPolarity软件并显示在径向直方图(谭et al ., 2021)。在野生型控制表皮,Celsr1 Fz6和Vangl2都浓缩在一个p结点,从马丁连接耗尽,这沿着p轴不对称高度一致(图3 a - b”)。像预期的那样从先前的研究Celsr1^Crsh突变小鼠(Devenport和福克斯,2008;Stahley et al ., 2021),我们发现,卡式肺囊虫肺炎蛋白质不对称性大大降低Celsr1^−−/突变体。Celsr1免疫荧光强烈减少细胞连接(图3 c),Fz6和Vangl2分布更均匀的外围地区基底细胞相比,控制(图3 d d ')。相比之下,不对称的三个核心卡式肺囊虫肺炎蛋白质主要是未受影响Celsr2^−−/突变体。尽管Fz6和Vangl2定位出现大幅减少集中在路口,不对称的量化显示他们的极性的大小和方向与野生型控件(图3 e-f”),符合毛囊中观察到的正常调整Celsr2^−−/突变体(图2 c)。Fz6和Vangl2不对称更严重减少Celsr1^−−/;Celsr2^−−/双突变体胚胎相比Celsr1^−−/单突变体(图3的高度差),这表明在缺乏Celsr1, Celsr2卡式肺囊虫肺炎蛋白质定位确实提供适度的贡献。值得注意的是,尽管Fz6和Vangl2极化损失Celsr1^−−/;Celsr2^−−/双突变体,我们没有观察到明显的减少膜招聘Vangl2或Fz6 (图3的高度差)。这表明,与Fmi果蝇Celsr蛋白质不需要流量和/或保留Fz Vangl细胞连接,而是将它们组织到极化联接的装配。

图3

图3。失去核心卡式肺囊虫肺炎的表皮蛋白不对称Celsr1^−−/和Celsr1^−−/;Celsr2^−−/双突变体。(a)代表的平面视图interfollicular表皮的基底层E15.5 Celsr1, Fz6 Vangl2分布,通过免疫荧光检测。前是左边。酒吧规模:20µm。放大与彩色线下面覆盖的区域代表轴(线角)和大小(线长)的极性。量化的极性分布在环形直方图显示如下。(a - b′)Celsr1(一),Fz6(B)和Vangl2 (B′)WT胚胎,n = 11951基底细胞,3个胚胎。(c - d′)Celsr1(C),Fz6(D),Vangl2 (D′)Celsr1^−−/胚胎,n = 11629基底细胞,3个胚胎。(E-F′)Celsr1(E),Fz6(F)和Vangl2 (F′)Celsr2^−−/胚胎,n = 12099基底细胞,3个胚胎。(G-H′)Celsr1(G),Fz6(H)和Vangl2 (H′)Celsr1^−−/;Celsr2^−−/胚胎,n = 9064基底细胞,3个胚胎。

微分Celsr1稳定性和Celsr2同型的粘连细胞连接

迄今为止我们的数据表明,尽管他们相对类似的表达在皮肤水平和模式(Sennett et al ., 2015;和艾伦老鼠大脑图集,developingmouse.brain-map.org/experiment/show/100057665;developingmouse.brain-map.org/experiment/show/100055676) Celsr1 Celsr2贡献非常不同,卡式肺囊虫肺炎表皮的功能。Celsr1扮演更重要角色而Celsr2在很大程度上是可有可无的。我们假设也许是两个epidermally-expressed Celsr蛋白质显示不同的粘附性能和/或能力与已知的卡式肺囊虫肺炎伙伴交互,这或许可以解释他们的不同贡献卡式肺囊虫肺炎的功能。探讨这个问题,我们首先比较Celsr1亲同种抗原的交互和Celsr2交界浓缩试验中培养的角质细胞。Celsr1-GFP或Celsr2-GFP构造是暂时性的转染到主要鼠角质细胞的backskins中提取出来的Celsr1^−−/;Celsr2^−−/双突变体胚胎生成在这项研究中,只介绍GFP-tagged蛋白质功能Celsr蛋白质。胶粘剂层被增加诱导钙离子浓度在媒体上以允许cadherin-based信息附着力。化验,Celsr1-GFP成为选择性地富集在两个Celsr1-GFP表达细胞钙之间的接口和ectodomain-dependent方式指示cadherin-domain介导的浓缩是一个结果亲同种抗原的Celsr1蛋白质在相邻细胞之间的相互作用(Devenport和福克斯,2008)(图4一,补充图S4)。测量程度的浓缩,我们计算一个联接的浓缩得分(我)细胞对表达Celsr-GFP(意思是联接的强度比细胞的平均强度对)(图4 b)。膜相关GFP-CAAX被用作负控制基线浓缩观察当相邻细胞的膜重叠(我^GFP−CAAX< 2)(图4 a, B)。从之前的研究预计,Celsr1强烈丰富表达之间的联接的接口细胞平均浓缩约4分(Stahley et al ., 2021)(图4 a, B,补充图S4)。Celsr2-GFP本地化,相比之下,明显更加分散在细胞对(图4 a, B,补充图S4;意思是我^Celsr2−GFP2.5∼)但还是丰富程度大于GFP-CAAX基线(意思是我< 2)(图4 a, B)。这表明Celsr2 homophilically交互在反式在上皮细胞。这个结果符合Celsr2调解聚合的能力S2细胞(日本岛et al ., 2004)。有趣的是,当细胞转染与Celsr1-3xFLAG涨跌互现Celsr2-GFP表达细胞,他们成立了异形的连接在反式在对混合单元(图4 e)。的浓缩与Celsr1-3xFLAG Celsr2-GFP Celsr1/2异形的路口,然而,低于浓缩Celsr1-GFP Celsr1-3xFLAG (图4 e, F)。这个观察表明,尽管Celsr1差异和Celsr2同型的连接,他们ectodomains足够相似heterotypically交互。

图4

图4。Celsr2丰富在信息连接同型的相互作用不如Celsr1有效。(一)代表图像的细胞对表达Celsr1-GFP Celsr2-GFP或GFP-CAAX表示。底部面板显示放大交界地区。注意在路口处Celsr1-GFP Celsr2-GFP相比更强的浓缩和两种亚型在路口处更丰富而non-junctional质膜GFP-CAAX标志。酒吧规模20µm(前面板)和10µm(下半部分)。(B)交界的情节浓缩评分(交界意味着强度比细胞的平均强度对)。n = 32 Celsr1-GFP路口,n = 43 Celsr2-GFP路口,n = 60 GFP-CAAX连接。Kolmogorov-Smirnov测试p< 0.0001。数据汇集从两个独立的实验,每个实验反映了代表趋势。(C)荧光光漂白后复苏(收紧)交界Celsr1-GFP Celsr2-GFP。代表图像显示单元之间的交界地区对表达Celsr1-GFP或漂白前后Celsr2-GFP表示。漂白roi,黄色箭头。(D)收紧复苏的阴谋。是归一化平均强度标准差的漂白剂和恢复配置文件绘制与时间Celsr1-GFP(蓝色)和Celsr2-GFP(红色)连接(粗体)和自由细胞边缘不并列转染细胞(浅色)。(n = 36 roi Celsr1边缘,38 roi Celsr2边缘,78 roi Celsr1连接和75 roi Celsr2连接)。数据汇集从两个独立的实验细胞边缘测量和三个独立实验结测量。(E)细胞之间的混合实验细胞表达Celsr1-3xFLAG和Celsr2-GFP(板)或Celsr1-3xFLAG和Celsr1-GFP(底部面板)。图像显示细胞对形成异形的连接。Celsr1-3xFLAG似乎丰富Celsr1-GFP和Celsr2-GFP,在反式在信息连接。(F)直方图描述的频率Celsr1-3xFLAG: Celsr1-GFP和Celsr1-3xFLAG:: Celsr2-GFP连接整个范围的结浓缩比例获得Celsr1-GFP Celsr2-GFP,分别。插图显示了连接箱线图浓缩Celsr1-GFP和Celsr2-GFP的价值观。n = 56 Celsr1-GFP连接和n = 64 Celsr2-GFP连接。Kolmogorov-Smirnov测试,p= 0.0004。数据汇集从两个独立的实验。

信息的浓缩蛋白质粘附连接与他们相对静止在界面膜(Stahley et al ., 2021)。我们曾表明,Celsr1非常稳定细胞连接,它比交界固定钙粘蛋白(Aw et al ., 2016;Stahley et al ., 2021)。以确定Celsr2相对较低浓缩的同型的接口与膜流动性更大,我们进行了细胞对表达Celsr1-GFP或Celsr2-GFP收紧化验。小区域(1嗯直径)沿着连接或免费的边缘Celsr1-GFP或Celsr2-GFP表达细胞对photobleached和成像不断在4分恢复时期(图4 c,补充图S4)。荧光恢复曲线Celsr1和Celsr2几乎相同的地区自由边缘附近的蛋白质是最可能的细胞间膜内的扩散和自由(图4 d)。相比之下,在连接恢复的程度Celsr1 Celsr2截然不同。而Celsr1-GFP荧光强烈固定(固定分数∼80%在路口处与∼26%细胞边缘,估计平均安装痕迹)和恢复只有最低限度在整个恢复期,在路口处Celsr2-GFP相对少的流动减弱(固定分数∼43%在路口处与∼28%细胞边缘,从拟合估计平均痕迹)(图4 d)。这些数据表明,胶交互Celsr上皮蛋白的连接并不等价,Celsr1交互导致更大的稳定和交叉的浓缩。

Fz6和Vangl2招募两Celsr1-and Celsr2-homotypic粘连

Celsr1和一个重要的功能果蝇卡式肺囊虫肺炎建立Fmi是身体与其他跨膜核心组件,Fz稳索,在细胞连接,稳定他们,促进他们的组装成不对称,细胞间复合物(哈里森et al ., 2020;Stahley et al ., 2021)。此外,在果蝇、Fz、稳索积极反馈到Fmi稳定通过阻止它的内吞作用的去除膜(斯特拉特和斯特拉特,2008年;斯特拉特et al ., 2011)。因此,Fz差异和/或稳索协会可以解释为什么Celsr1卡式肺囊虫肺炎和Celsr2显示不同的联接的动力学和贡献。为了验证这个假设,我们问Celsr2能否重定向Fz6和Vangl2网站同型的粘附在培养的角质细胞,读出自己的协会,我们以前Celsr1显示(Devenport和福克斯,2008;Stahley et al ., 2021)。主要鼠角质细胞来源于Celsr1^−−/;Celsr2^−−/双突变体与Celsr1-GFP co-transfected或Celsr2-GFP Fz6-tdTomato或tdTomato-Vangl2细胞共同表达对我的分数计算。tdTomato-CAAX被用作负控制建立基线我分数一般膜标记。正如所料,Fz6-tdTomato和tdTomato-Vangl2都招募Celsr1-GFP本地化,成为强烈丰富的网站之间联接的接口共同表达细胞对(图5 a, B, G,我)(意思是我^负2−Fz6−。5,意味着我^{负2−Vangl2}−4.5)。蛋白质都大大丰富而消极控制tdTomato-CAAX (图5 c、G)(意思是我^负2−CAAX−2)。Fz6-tdTomato tdTomato-Vangl2也本地化Celsr2-GFP丰富连接(图5 d, E, G,我),我成绩显著大于tdTomato-CAAX (图5 f, G,我),这表明Celsr2能够关联Fz6和Vangl2并将其指向网站的亲同种抗原的附着力。然而,Fz6-tdTomato tdTomato-Vangl2浓缩时明显低于中的Celsr1-GFP (图5 g,我)。这种差异很可能是由于Celsr2本身的低我Celsr1相比,在相同的实验(图4 h-j,补充图S5的能力),而不是一个主要区别Celsr2与Fz6 Vangl2。Celsr1一样,我们从这些数据得出Celsr2可以招募Fz6 Vangl2网站亲同种抗原的附着力,推而广之,可能身体与蛋白质。

图5

图5。Celsr2新兵Fz6 Vangl2角化细胞连接,类似于Celsr1。(两者)细胞对共同表达Celsr1-GFP和Fz6-tdTomato代表(一),tdTomato-Vangl2(B)或non-junctional膜tdTomato-CAAX标志(C)。箭头标记之间的结结的2细胞和一个放大的视图表示低于相应的图像。规模酒吧= 20嗯。(D-F)细胞对共同表达Celsr2-GFP和Fz6-tdTomato代表(D),tdTomato-Vangl2(E)和tdTomato-CAAX(F)。箭头标记之间的结结的2细胞和一个放大的视图表示低于相应的图像。规模酒吧= 20嗯。(G)箱形图描绘结浓缩率Fz6-tdTomato tdTomato-CAAX相比发生时Celsr1-GFP或Celsr2-GFP (n = 33 Celsr1-tdTomato CAAX, n = 49 Celsr2-tdTomato-CAAX, n = 36 Celsr1-Fz6-tdTomato, Celsr1-Fz6-tdTomato n = 66)。(H)箱形图描绘结浓缩Celsr1-GFP值与在细胞共同表达Fz6-tdTomato Celsr2-GFP。(我)箱形图描绘结浓缩率tdTomato-Vangl2 tdTomato-CAAX相比发生时Celsr1-GFP或Celsr2-GFP (n = 66 - Celsr1-tdTomatoCAAX n = 87 - celsr2 tdTomatoCAAX, n = 63 - celsr1 tdTomatoCAAX, n = 67 - celsr2 tdTomatoCAAX)。(J)箱形图描绘结浓缩Celsr1-GFP和Celsr2-GFP细胞表达tdTomato-Vangl2。从两个独立的实验数据汇集Fz6-tdTomato tdTomato-Vangl2和三个独立的实验。Kolmogorov-Smirnov测试,* * * *p< 0.0001,* *p= 0.009。

讨论

的Celsr亚科的附着力GPCRs是必不可少的胚胎发育和神经系统的形成,但我们才刚刚开始理解函数的范围,这些很大的粘附分子执行以及附着力如何导致这些函数(王et al ., 2014;Goffinet迪西尔,2017)。通过生成新的Celsr1 Celsr2敲除老鼠菌株和检查这两个单引号和双突变体胚胎,我们已经确定的贡献Celsr蛋白质胚胎皮肤发展。因为Celsr3不是表达在皮肤上,我们的数据使我们能够自信地认为Celsr1是主要cadherin-based附着在表皮卡式肺囊虫肺炎GPCR功能。此外,我们也可以得出这样的结论:皮肤发展Celsr蛋白质的主要功能是建立卡式肺囊虫肺炎。其他关键发育过程在皮肤上如分层、毛囊规范,模式,downgrowth在很大程度上影响当所有Celsr函数删除。在分子水平上,我们已经确定了关键相同点和不同点的胶粘剂交互和动态Celsr1和Celsr2蛋白在上皮细胞连接。Celsr1胶粘剂接口和Celsr2足以吸引heterotypically相似和蛋白质都可以招募Fz6 Vangl2。尽管有这些类似之处,他们在同型的动力学胶粘剂接口是明显不同的。Celsr1主要是固定结而Celsr2可以分散更多的自由。这种差异反映在两种蛋白质的相对富集在路口。

在工作之前,我们表明,Celsr1非常稳定,细胞连接,在一个较低的流动性比交界钙粘蛋白(Aw et al ., 2016;Stahley et al ., 2021)。Celsr1静止部分由于集群交互Celsr1组织成大点状的总成,严重削弱的一个属性崩溃突变位于膜近端钙粘蛋白重复。尽管Celsr2可以调解细胞聚合时表达的无粘着力的悬浮细胞(日本岛et al ., 2004),这是糟糕的浓缩在上皮细胞联接的接口,并招募路口的分数比Celsr1展品具有更大的灵活性。这些粘合剂是否差异可以归因于不同的氨基端钙粘蛋白重复序列的尚不清楚。Celsr1和Celsr2份额55%氨基酸的身份,但这是他们的c端胞质反面,而不是他们的钙粘蛋白重复序列中最不同的。有趣的是残留的突变崩溃等位基因的Celsr1 D1040,映射到连接器之间的地区EC8 EC9, Celsr2是守恒的,然而Celsr2亲同种抗原的胶粘剂的特性更密切的模仿Celsr1^崩溃突变体比野生型Celsr1,暗示这对Celsr1残留是必需的,但还不够稳定协会细胞连接。有趣的是,Celsr1 Celsr2 Celsr1^崩溃突变的蛋白质都能招募核心卡式肺囊虫肺炎蛋白质Fz6和Vangl2连接(Stahley et al ., 2021),这表明它不是这些额外的卡式肺囊虫肺炎的存在蛋白质有利于Celsr1稳定的结。也许亲和力的差异trans-adhesive交互,cis-adhesive贪欲的交互,或在细胞质的身份绑定合作伙伴可能占不同的亲同种抗原的胶粘剂性能的两个Celsr蛋白质。执行与域交换Celsr1-Celsr2嵌合蛋白质粘附化验来区分胶粘剂差异是否由于细胞外,跨膜或胞质区域。虽然我们不知道这些差异的分子基础流动性和浓缩,我们建议他们有重要的功能的后果。

Celsr1稳定性差异及Celsr2粘连可能会使两种蛋白质在动态执行不同的功能与静态的细胞环境。Celsr1卡式肺囊虫肺炎是至关重要的皮肤,内耳,输卵管和室管膜细胞,都是相对静态的上皮组织组装健壮的、不对称的卡式肺囊虫肺炎复合物在细胞连接(科廷et al ., 2003;Devenport和福克斯,2008;Boutin et al ., 2014;施et al ., 2014;邓肯et al ., 2017)。静止的亲同种抗原的Celsr1粘连在这些网站可能是必不可少的卡式肺囊虫肺炎不对称。在果蝇翅膀,卡式肺囊虫肺炎不对称强烈与卡式肺囊虫肺炎组件的组装成稳定puncta (斯特拉特et al ., 2011;曹et al ., 2015;斯特拉特et al ., 2016)。此外,在小鼠表皮细胞,破坏Celsr1横向集群交互阻止不对称卡式肺囊虫肺炎复合物的形成(Stahley et al ., 2021)。相比之下,Celsr2很重要在神经元迁移和轴突寻路(日本岛et al ., 2004;日本岛et al ., 2007;瞿et al ., 2010;冯et al ., 2012;瞿et al ., 2014),过程可能需要粘合剂相互作用,可以快速周转,和Celsr2可能比等动力学Celsr1更好的装备。鉴于Celsr2可以招募Vangl2和Fz6胶粘剂网站表明,它可能形成更具活力PCP-like总成在上皮细胞比包含Celsr1神经元。有趣的是,单一Celsr同族体果蝇在上皮卡式肺囊虫肺炎、Fmi、函数以及神经系统的发展,所以它可以最有可能组装稳定和动态粘连细胞特定类型的方式(高et al ., 2000;Berger-Muller和铃木2011;清水et al ., 2011)。也许不同的Fmi拼接亚型表达在不同的细胞类型,或细胞类型特定的蛋白质相互作用调节Fmi的粘附状态。

尽管蛋白质域相似组织在3 Celsrs,目前还不清楚如果Celsr2(或Celsr3)可以作为核心卡式肺囊虫肺炎组件在脊椎动物中,定义在严格意义上的行为在组织细胞连接,以使细胞极性面(Devenport 2014)。鉴于Celsr2展品结与流动性崩溃Celsr1变异,有可能Celsr2不能在上皮细胞连接定位信息是不对称的。不幸的是,由于缺乏内生Celsr2可靠地检测到抗体在活的有机体内目前,我们不知道鼠标表皮Celsr2的本地化。进一步,尽管内源性表皮卡式肺囊虫肺炎的Celsr2不能取代Celsr1水平,我们不知道是否过度Celsr2可以补偿。此外,鉴于其角色在生物起源和极化的能动的纤毛在大脑中(迪西尔et al ., 2010;Boutin et al ., 2014),我们是开放的可能性Celsr2可能有一个功能相关的初级纤毛在皮肤上。然而,我们并没有观察表型与纤毛相关中断的皮肤Celsr2^−−/或Celsr1^−−/;Celsr2^−−/双突变体胚胎,如表皮厚度缺陷由于Notch信号受损或缺陷毛囊形态发生异常相关嘘信号(Ezratty et al ., 2011;戴et al ., 2013;陈et al ., 2015;杨et al ., 2015)。未来的研究在产后阶段将决定Celsr蛋白质功能之外的卡式肺囊虫肺炎在皮肤毛囊中的示例循环和再生或者在感觉神经元的迁移和神经支配。

实验程序

代的鼠标线和繁殖

所有鼠标工作是普林斯顿大学的机构批准的动物保健和使用委员会(IACUC)。老鼠被安置在一个AALAC——认证机构。住房、维护和饲养动物跟着指导的护理和使用实验动物和实验动物福利法案。

生成的老鼠基因组编辑核心设施Rutgers-Cancer新泽西学院使用CRISPR目标的起始站点和信号序列同时Celsr1和Celsr2基因。许多淘汰赛中生成和测序。两个鼠标线选择包含81个基点的删除生成的信号序列的开始,Celsr1 Celsr2,分别。N1创始人老鼠outcrossed C57Bl / 6 j五次。新等位基因命名Celsr1^{< em1Ddev >}和Celsr2^{< em1Ddev >},被保持为杂合子。

基因分型pcr是为了区分WT和脱线。基因型的Celsr1^{< em1Ddev >}等位基因,PCR引物设计围绕着81个基点删除,导致一个更小的碎片在淘汰赛。同样,基因型Celsr2^{< em1Ddev >}等位基因,PCR引物设计两侧的删除网站(补充图S1;看到表1PCR引物序列和预期产品的大小)。

表1

表1。产品信息的关键抗体和试剂用于这项研究。

免疫印迹分析

表皮溶解产物是通过解剖backskin P0 - P2产后幼崽。提取蛋白质,backskins flash在液态氮冷冻,然后磨成粉末在cryomill机(Retsch、新城、PA) 30年代时使用液态氮冷冻。对于每个backskin, 700 ul里帕缓冲区(Abcam)添加到磨粉,样本漩涡,然后孵化冰15分钟。在冰上孵化后,样本离心机在17000克15分钟在4°C。上层清液被移除和加工通过免疫印迹。标准协议进行免疫印迹,蛋白质是解决7.5% SDS凝胶,转移到硝酸纤维素(Bio-Rad),并使用主Celsr1抗体检测(Devenport和福克斯,2008),Celsr2(山羊、研发系统,1:200)和钙粘蛋白(兔、细胞信号、摘要或老鼠,ThermoFisher, 1:1000)。IRDye680和IRDye800二级抗体(LI-COR 1:10,000)和LI-COR奥德赛CLx成像系统被用来检测。看到表2抗体和试剂的完整列表。

表2

表2。细节Celsr1和Celsr2包括pcr引物序列为WT和基因敲除动物和产品尺寸。

免疫荧光和胚胎backskins图像采集

固定和染色backskins是如前所述(Basta et al ., 2021)。短暂,E15.5胚胎被固定在4%多聚甲醛在PBS + + 1 h在室温下。所有抗体除了P-cadherin, backskins解剖和阻塞在4°C 2%正常山羊血清,2%正常驴血清(或4%正常血清驴子和山羊血清Fz6当染色),1%的牛血清白蛋白和1%的鱼明胶PBT2 (PBS Triton x - 100)的0.2%。P-cadherin,正常山羊血清样本被封锁在2%,2%正常驴血清,1%牛血清白蛋白和1%的鱼明胶TBT2 (TBS Triton x - 100)为0.2%。孵化后,样品被孵化主要抗体PBT2块(TBT2块P-cadherin染色)一夜之间在4°C。样品在PBT2洗五次在室温下至少30分钟,孵化与二次抗体和赫斯特(表达载体,猫:H1399 1:1000)一夜之间在4°C,然后洗PBT2至少10分钟的三倍。在PBS最终清洗后,样本安装在延长黄金。

以下主要使用抗体:豚鼠anti-Celsr1 (Danelle Devenport, 1:1000),兔子anti-E-cadherin(摘要、细胞信号:3195),鼠anti-Vangl2(1:10 0,微孔,猫:MABN750),山羊anti-Fz6(1:400、研发生物系统、猫:AF1526),兔子anti-Sox9(微孔,AB5535 1:1000),鼠anti-P-cadherin (Clontech, M109 1:200)。555年488年Alexa萤石−−−647二级抗体被用于1:20 00(表达载体或杰克逊ImmunoResearch)。看到表2抗体和试剂的完整列表。

对于毛囊极性分析,图像获得使用尼康A1R-Si共焦显微镜由NIS元素软件,使用PlanApo 20×0.75 60×1.4 NA NA空气和油浸目标分别共振和检流计图像捕获。20×图像被缝在NIS元素和加工在斐济生成平均强度投影(AIP)的自动分割和角计算的输入MATLAB算法。在斐济60×图像处理。

分析核心卡式肺囊虫肺炎蛋白质不对称在基底层,照片被收购了尼康A1R-Si共焦显微镜由NIS元素控制软件使用PlanApo 60×1.4 NA石油。图像处理的元素和ImageJ使用NIS。

隔离的主要角化细胞和角化细胞文化

角化细胞分离得到Celsr1^−−/;Celsr2^−−/幼崽在P1和建立细胞系使用以前公布的协议(诺瓦克和福克斯,2009年)。角化细胞种植在实验室使用E-Media准备根据出版协议(诺瓦克和福克斯,2009年)补充50µM氯化钙。现场收紧实验中,酚红免费DMEM和F-12无色成像E-media做准备。修改后使用Effectene细胞转染试剂制造商的协议。300 ng DNA转染的混合用于每个12-well板和400 ng质粒DNA用于每个6-well盘子和35 mm成像菜。。co-transfection与两个不同的质粒,其中一个是Celsr1-GFP或Celsr2-GFP, 2:1的比率Celsr1 / Celsr2:所使用的其他质粒DNA。看到表2质粒的完整列表用于这项研究。

结浓缩化验,大约有100000的角化细胞被播种到纤连蛋白涂层1.8毫米,1.5 #玻璃盖玻片在每个12-well板块。大约24小时种子期后,细胞与必要的质粒转染。24小时后转染细胞从低钙E-media(50µM)高钙E-media包含1.5毫米Ca^{2 +}。孵化24小时后,细胞被固定和彩色成像(见下文)。异形的结浓缩化验,−150000细胞被播种到每一个6孔板。24小时后播种,每个也都分别转染的以下结构:Celsr1-3XFLAG, Celsr1-3X-Myc, Celsr1-GFP或Celsr2-GFP。24小时post-transfection细胞使胰蛋白酶化,混合和山肩,一个Celsr1-FLAG或Celsr1-Myc转染以及结合要么Celsr2-GFP Celsr1-GFP或一个好之一。−从1:1的混合物被播种到180000个细胞纤连蛋白涂层1.8毫米,1.5 #玻璃盖玻片在每个12-well板块。4 - 5 h后电镀,媒体转向E-media包含1.5毫米Ca^{2 +}。额外的24小时后,细胞被固定和染色显微镜。

免疫荧光的角化细胞

在高钙E-media孵化后,汇合的层的角化细胞冲洗在PBS含有钙和镁(PBS + +)和固定在PBS + + 4% PFA准备10分钟在室温下,紧随其后的是透化作用在PBS 10分钟含有0.1% Triton-X 100 (PBT1)。主要抗体稀释1:20 00在PBT1和细胞孵化后30分钟。主要抗体治疗,细胞被洗了三次在PBS和进一步孵化30分钟在二级抗体和赫斯特在PBS稀释至1:20 00。细胞终于洗了三次PBS和安装在玻璃幻灯片使用延长黄金,治愈了一夜的黑暗和成像。

图像分割和极性分析

年代egmentation基底的表皮细胞和极性分析核心卡式肺囊虫肺炎的蛋白质。细胞构成(斯金格et al ., 2021)是用于部分图像整个山的胚胎表皮。分割得到了面具使用粘附或P-cadherin标记,进行后期处理和面具,手在ImageJ纠正。相同的面具从粘附或P-cadherin标记用于其他渠道的形象。

如前所述,使用极性分析组织分析仪ImageJ V2软件(Aigouy et al ., 2010;Basta et al ., 2021)。细胞边缘分割定义的面具产生如上所述。组织分析仪使用分割面具来计算轴和大小(向列顺序)膜局部的蛋白质(如中定义Aigouy et al ., 2016),包括对PCP的蛋白质。使用MATLAB生成环形直方图绘制数据,平均极性大小表明极性的角度和力量。分析之前,图像旋转,使之与前后轴。

毛囊的分割和极性分析。确定毛囊生长的方向,AIP图像进行了分析使用一个定制的MATLAB脚本视觉紧随其后特别的手修正。这个脚本部分地区的毛囊基于Sox9和P-cadherin荧光强度和使用分段区域之间的几何关系来分类极化和无极毛囊以及计算角极化毛囊的生长。

图像采集和分析结浓缩试验

细胞成像使用PlanApo 20×0.75 na空中目标与额外的变焦尼康A1R-Si共焦显微镜使用的相关组合405,488,561,643 nm激光照明。图像采集是按顺序进行,避免渗滤。最大强度投影从Z栈在斐济。图像减去背景。roi沿着连接被吸引,Celsr1-GFP / Celsr2-GFP / GFP-CAAX适用。另一个ROI是沿着外围参与的细胞或两个相邻细胞共享连接,如适用。比得到的背景修正意味着结的强度和细胞对/单个细胞ROI如下:

结 浓缩 = \frac{边境 的意思是 强度}{细胞 或 细胞 一对 的意思是 强度}

收紧

大约150000角化细胞被播种在# 1.5玻璃盘子底部涂上纤连蛋白(ibidi # 81151)。20 - 24 h post-plating,细胞被瞬变与Celsr1-GFP或Celsr2-GFP质粒转染。24 h post-transfection细胞转向E-media包含1.5毫米Ca^{2 +}和额外的20 - 24 h Celsr1-GFP和孵化Celsr2-GFP表达式。在成像之前,细胞转向无酚红E-media包含1.5毫米Ca^{2 +}玫瑰和20毫米。使用488 nm激光细胞成像,计划7月60×1.4 na油浸物镜(附加放大呈现一个像素大小的110海里)在尼康A1R共焦显微镜配有stage-top Tokai-Hit孵化室保持37°和5%的公司₂。保持放大,激光功率(漂白剂和收购),像素住时间和所有测量,采集速率常数1-um直径圆形漂白剂roi和三个roi /图像创建样例结(s)或细胞边缘(s)。收紧采集序列由三个参考pre-bleach图像紧随其后的是漂白剂(5.9秒),最后与5 s 60帧间隔监测荧光恢复。获得的图像在时间序列检查任何在斐济XY-drift Z-drift并纠正。参考ROI是non-bleached地区在图像采集正确的整体漂白。创建一个背景ROI在每个细胞外的形象。提取ROI值漂移校正图像在NIS元素随后分析软件在Microsoft Excel和Graphpad棱镜。每个图像时间序列是背景和漂白剂纠正(称为今后纠正强度)和此后概要文件被规范化为修正后的强度(F_t- f_漂白剂)/ (F_ini- f_漂白剂),F_t是纠正ROI强度在给定的时间点,F_漂白剂修正后的强度在时间点后立即漂白,F_ini是均值ROI强度的三个pre-bleach帧。每个意味着恢复曲线拟合指数一阶段协会方程Graphpad棱镜和安装的高原和Y₀值被用来确定固定的比例=1 - {(Plateau-Y₀)/ (1 - Y₀)}。每个条件的平均跟踪拟合模型平方值> 0.93。

数据分析使用尼康NIS元素和ImageJ /斐济和Microsoft Excel。图表绘制使用Graphpad棱镜。数据代表汇集从至少两个独立的实验细胞边缘和至少三个独立实验连接,每个实验之前,代表趋势。

统计数据

细节与样本容量、误差和描述统计学意义在每个图的传说。结浓缩比率的分布和细胞之间的差异意味着强度是通过非参数使用Graphpad棱镜的KS测试软件进行测试。

数据可用性声明

原始数据支持了本文的结论将由作者提供,没有过度的预订。

道德声明

动物研究被普林斯顿IACUC进行审核和批准。

作者的贡献

磅概念化的研究、设计、验证和分析Celsr1和Celsr2单引号和双鼠标突变体,进行实验和数据分析,描述卡式肺囊虫肺炎蛋白质不对称,并导致了论文的写作和编辑。PS和完成实验设计,数据分析和可视化研究Celsr1 Celsr2粘合剂性能和交叉的流动性,以及论文的撰写和编辑。RJ执行实验,数据分析和可视化分析Celsr1毛囊的方向,Celsr2和双基因敲除的胚胎,导致论文的写作和编辑。KL建立设计并进行实验,验证和描述Celsr1 Celsr2单引号和双基因敲除小鼠,并编辑。GH-L发达的分析管道进行自动分割和极性分析胚胎毛囊。DD监督所有方面的研究设计、执行、数据分析和论文中写道。

资金

NIAMS研究报告在这发表支持的美国国立卫生研究院在格兰特数字R01 AR066070 (DD)和F31 AR077407(磅),数量和由美国国家卫生研究院的格兰特T32 GM007388(磅)。

确认

我们感激地承认Devenport实验室的成员建议,活泼的讨论,有用的反馈和技术专长。我们感谢彼得Romanienko和基因组编辑核心设施Rutgers-Cancer新泽西学院设计和代Celsr1 Celsr2 gene-edited老鼠。由于加里Laevsky和沙王在普林斯顿共焦核心设施,尼康卓越中心。我们感谢康纳养家糊口和约书亚Rabinowitz利用cryomill表皮蛋白分离和援助。佐藤Uemura慷慨地提供了Celsr2-GFP质粒。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

出版商的注意

本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。

补充材料

本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fcell.2022.1064907/full补充材料。

引用

Aigouy B。,Farhadifar, R., Staple, D. B., Sagner, A., Roper, J. C., Julicher, F., et al. (2010). Cell flow reorients the axis of planar polarity in the wing epithelium of Drosophila.细胞142年,773 - 786。doi: 10.1016 / j.cell.2010.07.042