τ磷酸化和垫接触轴突生长的调控
s·l·莫里斯
s t·布雷迪- 解剖学与细胞生物学系,伊利诺伊大学芝加哥,芝加哥,美国
作品简介:τ是一种微管相关磷蛋白质主要在神经元。盛行的教条继续微管稳定定义为τ的主要功能在活的有机体内,尽管几行证据表明情况并非如此。最重要的是,τ零老鼠赤字在轴突产物和神经元迁移,同时还拥有一个广泛的微管网络。相反,越来越多的证据表明,τ可能快的主要功能的调节轴突运输(脂肪)通过神经信号通路的激活。先前的研究发现了一种磷酸酶激活域(PAD)τn端通常是隐藏的,但在tauopathies既定的暴露。暴露时,垫激活信号级联PP1和GSK3β影响细胞功能包括来自驱动蛋白的释放货物。此外,我们发现垫接触可以由一个在T205磷酸化。接触垫是一个早期事件的多个tauopathies和神经退化的一个主要因素与τhyperphosphorylation有关。然而,τ垫接触对顺行性脂肪的影响提出了有趣的可能性,这一途径可能是生理机制的监管货物交付通过特定站点的磷酸化τ和瞬时激活PP1 GSK3β。值得注意的是,已经有证据表明局部控制PP1和GSK3β网站需要提货。
方法:调查这一假设,我们首先进行细胞定位的τ垫接触,pT205τ磷酸化,和活跃的GSK3β主要在开发过程中海马神经元。第二,我们分析了轴突的τ淘汰赛神经元与全长hTau40-WT转染后,hTau40-ΔPAD或hTau40-T205A。
结果和讨论:这里给出的结果表明,瞬态PP1-GSK3β信号通路的激活通过本地监管垫接触货物交付机制,从而对神经突重要发展中神经元的产物。
1介绍
神经元分化细胞的轴突可以扩展几千倍的胞体的直径。此外轴突不均匀区域,但可能包括成千上万的离散的子域,如Ranvier的节点和突触前终端,具有复杂、特殊蛋白质成分。神经元极性和轴突子域是建立在开发过程中神经系统中神经前体细胞分化并接受神经突结果与轴突和树突细胞向外扩展。膜扩张是优先在轴突尖,这逐渐进一步从胞体,需要活跃的膜,蛋白质和细胞器的快轴突运输(脂肪)(Pfenninger弗里德曼,1993;克雷格et al ., 1995;Futerman和银行家,1996)。它早就知道,阻碍轴突运输囊泡抑制轴突生长和诱导生长锥崩溃(好好地et al ., 1993)。此外驱动蛋白突变体,如KIF5A−−/神经元,减少了副产物(卡乐et al ., 2012)。尽管脂肪和选择性的重要性交付货物的具体位置,货物运输和交付的生理调节机制仍然难以捉摸。
τ是一种微管相关蛋白发现主要在神经元。它最初是孤立与微管从大脑和被称为微管组装的关键在体外(温嘉顿et al ., 1975)。盛行的教条继续定义τ的主要功能在活的有机体内微管稳定,即使几行证据表明情况并非如此。最重要的是,τ零老鼠赤字神经突和神经元迁移产物在体外和在活的有机体内同时还拥有一个广泛的微管网络(原田et al ., 1994;道森et al ., 2001;Sennvik et al ., 2007;萨丕尔et al ., 2012)。此外,τ表达式与神经元成熟(Fiock et al ., 2020)和τ蛋白浓缩在动态微管神经突生长结束时(黑色et al ., 1996)。在体外野生型(WT)海马神经元遵循典型的时间表的结果(巴特利特和银行家,1984;多蒂et al ., 1988;弗莱彻和银行家,1989)。经过短暂的多极阶段,多个短流程同样增长,一个进程开始快速增长,成为轴突而其他进程依然停滞不前。2 - 3天后短流程重启经济增长以较慢的速度延伸和分支成为树突(多蒂et al ., 1988)。τ击倒在初级小脑神经元阻止神经突伸长剩下细胞早期多极阶段直到τ的表情恢复(卡塞雷斯和Kosik, 1990;卡塞雷斯et al ., 1991)。τ淘汰赛海马神经元轴突和树突伸长(也会降低道森et al ., 2001)。
在研究生物活动正常的评估(Morfini et al ., 2007)和病理τ(LaPointe et al ., 2009;Kanaan et al ., 2011),一个磷酸酶激活域(PAD)的氨基端τ被确认。暴露时,垫激活信号级联涉及蛋白磷酸酶1 (PP1)和糖原合酶3β(GSK3β)(LaPointe et al ., 2009;Kanaan et al ., 2011)。被脱去磷酸PP1激活GSK3βpSer9激酶的活性形式。激活GSK3β导致驱动蛋白的磷酸化轻链(KLC)和触发囊泡的释放货物(Morfini et al ., 2002;Kanaan et al ., 2011)。接触的垫已被证明是一个早期事件在多个tauopathies和神经退化的一个主要因素(Kanaan et al ., 2011;Kanaan et al ., 2012;考克斯et al ., 2016;Kanaan et al ., 2016)。然而,隔离垫在正常τ的存在提出了这样的可能性,这一领域会有正常的生理功能。独家τ垫对顺行性脂肪的影响提出了有趣的可能性的生理调节通过瞬时激活PP1和GSK3β提货。值得注意的是,已经有证据表明局部控制PP1和GSK3β发生在网站需要提货。例如,在轴突产物活性GSK3β浓缩在生长锥(Morfini et al ., 2002;Morfini et al ., 2004)。此外,众所周知,在轴突神经纤维细丝是高度磷酸化除了在Ranvier的节点(谢长廷et al ., 1994;马提尼,2001)。这是归因于更高的磷酸酶活动在这一领域,但是这个地方的生理功能激活和调节机制是未知的(de Waegh et al ., 1992;谢长廷et al ., 1994)。我们假设PP1-GSK3β信号通路的激活规范特有的接触垫是一种机制来提货,因此重要的神经突发展中神经元的产物。
2方法
2.1动物
协议批准的机构下的所有实验动物保健和使用委员会在芝加哥伊利诺伊大学(UIC)。所有的动物都被安置在生物资源实验室UIC 12 h下光/暗周期和提供食物和水随意。野生型(WT) C57BL / 6小鼠(杰克逊实验室,# 000664),Mapttm1Hnd(τ淘汰赛(KO))(杰克逊实验室,# 007251 (道森et al ., 2001)),雄性sd大鼠中(Charles River)是用于实验研究。WT C57BL / 6或纯合子τKO雄性和雌性老鼠配对内部定时怀孕。女性timed-pregnant Sprague-Dawley老鼠从查尔斯河实验室购买。
2.2主要海马神经元的文化
胚胎收集从WT或τ淘汰赛C57BL / 6小鼠在胚胎16.5天(E16.5),或在一天胚胎的雄性sd大鼠中18.5 (E18.5)。海马是大脑两个半球的解剖和收集在冰冷的1 x汉克斯平衡盐溶液(哈佛商学院;Gibco # 14185052)。组织中分离胰蛋白酶(Gibco # 15140148) 15分钟前37°C水浴仔细洗3次1 x哈佛商学院。胰蛋白酶是通过添加杜尔贝科释放修改鹰介质(DMEM;Gibco # 11995065)补充10%胎牛血清(的边后卫;Gibco # 16000044)和1 x青霉素和链霉素(笔/喉炎的症状;Gibco # 15140122) (DMEM + +)。组织被磨碎成单个细胞悬液,玻璃巴斯德吸管后跟flame-polished巴斯德吸管直径降低了50%。细胞的数量与血细胞计数器计数和细胞集中的解决方案是1-2x10稀释4细胞/要求,在DMEM + +。细胞被镀上6-wellμ-Slide VI 0.4 (Ibidi # 80606)室幻灯片涂有0.5毫克/毫升保利-l赖氨酸(锁相环;σ# P1399)硼酸缓冲和10μg 0.1 /毫升层粘连蛋白表达载体(# 23017015)。电镀后细胞在一个无菌湿润孵化器孵化37°C公司为5%24 h在这段时间里,他们经历了50%的媒体变化Neurobasal™介质(Gibco # 21103049)补充1 x B27™+ (Gibco # A3582801), 1 x笔/喉炎和0.5毫米GlutaMAX™(Gibco # 35050061) (NB + + +)。细胞被维护在一个无菌湿润孵化器37°C公司为5%2实验期间媒体改变了50%的新鲜NB + + +每3 - 4天。
2.3转染主要海马神经元
轴突的实验产物,主要小鼠海马神经元与NeuroMag转染转染试剂(OZBiosciences # NM50500)根据制造商的指示。神经元τKO小鼠转染16 h与hTau40-WT电镀后,hTau40-ΔPAD或hTau40-T205A。所有τ构造包括c端mCherry标记(图1一个)。转染复合物被混合组装1μL NeuroMag试剂0.5μg DNA在20μL unsupplemented neurobasal媒介。15分钟后在室温下孵化(RT)、文化媒体被从每个好,轻轻地与转染复合物混合之前添加回细胞。细胞培养板被放置到一个磁板(OZBiosciences # MF10000) 15分钟在37°C。Post-transfection细胞被维护在一个孵化器,直到为免疫细胞化学定位。
图1。图表的DNA结构用于转染和代表结果图像。(一)图表的全长hTau40 DNA用于转染τKO海马。神经元是转染16 h在电镀和维护文化进一步72 h。(B)1)代表图像神经突前测量。蓝色:DAPI,白色:β3-tubulin)。所有生物神经元,从核和微管蛋白完整、完全包含在图像被确定神经突测量之前和编号。2)代表图像的微管蛋白免疫细胞化学神经突后测量NeuronJ插件。所有测量和分支神经突前作为主要特征(品红,*),中等(黄色,■),或三级(红、▲)。
2.4免疫细胞化学
0.4主要海马神经元培养6-wellμ-Slide VI (Ibidi # 80606)室幻灯片是免疫细胞化学固定。去除培养基后,每个好仔细冲洗1 x细胞骨架缓冲区(10毫米MES, 138毫米氯化钾,3毫米MgCl2之前,EGTA 4毫米,pH值6.1)神经元被固定在微管提取缓冲MgCl(80毫米管道、2毫米2,EGTA 1毫米,Triton-X 0.3%)与0.25%的戊二醛90年代之后,4%的多聚甲醛1 x tris-buffered盐水(TBS) 10分钟。这些细胞被洗两次1 x TBS 10分钟。新鲜TBS添加和神经元被储存在4°C。样本与50 mM NH孵化4Cl 10分钟RT淬火自体荧光然后洗一次1 x TBS 10分钟之前permeabilized Triton-X 0.1% 1 x TBS 10分钟。神经元被封锁在1 x 5%牛奶或1% BSA TBS 1 h RT然后冲洗两次与前1 x TBS孵化主要抗体(补充表S1)稀释1 x TBS一夜之间在4°C。第二天,神经元在1 x TBS洗3×5分钟然后孵化与二次抗体1 h rt,如果需要,样本与1 x TBS冲洗然后用Phalloidin-AlexaFluor孵化647 30分钟在rt,样本洗1 x TBS 10分钟后10分钟孵化2μg /毫升赫斯特33342(热科学、# 62249)。样本再次洗1 x TBS前10分钟延长黄金不变色安装介质(热费希尔科学、# P36930)被添加到每个。样本存储在一个parafilm-sealed 1000毫米盘包裹在铝箔在4°C到成像。
2.5共焦成像
的程度colocalization TNT1和pT205生长锥和轴突由强度评估相关分析(ICA)使用ImageJ JACoP插件(Bolte拍摄Cordelieres, 2006)。这种方法的一个变体皮尔逊colocalization相关性偏向高着色强度较小。图像栈分离成单个渠道分析,绿色和红色通道。在JACoP插件,使用成本的自动阈值在每个图像李的ICA紧随其后。比较(R我- ravg)(G我- gavg),正值表明colocalization而负值代表缺乏co-localization。
免疫细胞化学后,神经元在Ibidi钱伯斯被共焦显微镜成像蔡司LSM 710或880年蔡司LSM Airyscan。图像被使用25 x 40 x或×63目标提出了油浸和马克斯投影。图像测量了轴突的结果与×25目标油浸在一个z平面。
2.6 WT的神经突结果分析和τKO神经元
神经突的WT或τKO神经元培养Ibidi钱伯斯24,72或96 h进行了分析使用ImageScience NeuronJ ImageJ插件。所有活细胞,根据核染色和微管蛋白完整、完全包含在每一个图像在ImageJ编号。合并后的图像被分割成单个通道和微管蛋白通道被打开NeuronJ插件。所有测量和分支神经突前一个神经元分为初级、二级或三级神经突(图1 b)。由此产生的测量比较进行分析,每个神经元的过程重复所有图片/实验。平均50神经元测量,跨两个井,对于每一个生长基质和计算,每实验。以下变量为每个神经元进行了分析:总探明长度,最长的主要神经突长度、其他主要探明总长度,基本探明数量,总数分支神经突(二、三级),最长的主要神经突的分支,总数和总长度的分支。分析了每个变量单向方差分析与Šidak多个个人比较比较试验。意义是p< 0.05。所有统计比较GraphPad棱镜9.0.0和图表生成。
3的结果
3.1暴露的τ垫和pT205τ硝唑在网站的活跃提货dephospho-Ser9-GSK3β类似活跃
鱿鱼轴浆,τ垫都是必要而充分的为特定的抑制顺行脂肪通过激活PP1 / GSK3β信号级联(Kanaan et al ., 2011)。此外,pseudophosphorylation T205τ的脂肪还能抑制顺行依赖暴露GSK3β垫和激活(莫里斯et al ., 2021)。以前的研究已经表明GSK3β可以直接使磷酸化KLC和促进释放驱动蛋白的膜结合细胞器(MBO) (Morfini et al ., 2002)。独家的顺行性脂肪抑制这个途径导致的假设接触垫在特定轴突子域是一种机制规范MBO交付常规驱动蛋白。
GSK3先前表明,而蛋白质是在生长锥,局部不活跃phospho-Ser9-GSK3β只包括一小部分总蛋白质的建议活动dephospho-ser9-GSK3β(的存在Morfini et al ., 2002)。为了证实这一点,主要从∼海马神经元E16.5小鼠胚胎培养2、7、10天前被固定和double-stained dephospho-ser9-GSK3β(dp-GSK3β)和phospho-Ser9-GSK3β(p-GSK3β)。所示图2优先,积极dp-GSK3β局部神经突的生长和在生长锥的中央部分早期产物(2天在体外(DIV);图2一个),后来发展(10 DIV;图2 d),这与先前的报道是一致的(Morfini et al ., 2002)。评估τ的接触垫和τ磷酸化在生长锥,主要海马神经元也沾染了TNT1组合,pT205τ,和总τ。类似于活跃dp-GSK3β垫接触(TNT1免疫反应性)和pT205免疫反应性神经突的硝唑和在生长锥在早期(图2 b, C;补充图S1)和(图2 e;补充图S1)发展的时间点。
图2。活跃的dp-Ser9-GSK3β垫接触,pT205τ在生长锥本地化。WT海马神经元培养两个DIV(两者)或10 DIV(d e)应用了不活跃phospho-Ser9-GS3β(绿色)和主动dephospho-Ser9-GSK3β(红色)(A, D)或TNT1(红色)(B, C, E),总τ(白色)(B)或pT205τ(绿色)(C, E)。所有神经元也沾phalloidin可视化肌动蛋白(红色)。(A, D)活跃dpGSK3β是中部地区丰富的生长锥(箭头)而非活动pGSK3β沿着神经突生长均匀分布和整个生长锥(箭头)。(C, E)在早期和晚期发育时间点,TNT1最后pT205τ可见免疫反应性神经突生长和生长锥的中部地区。规模的酒吧:5μm DIV (2);10μm (10 DIV)。
调查τ垫的接触,T205τ磷酸化和dp-GSK3β整个神经元的分布在不同的发展阶段,整个细胞也被可视化。在早期发育的计算(2 DIV) TNT1 (图3一)和pT205 (图3 b)在细胞体内免疫反应性普遍存在和最长的神经突,假定轴突。非活性磷的和活跃的dephospho-GSK3β有相似的分布(图4一)。垫接触的位置变得越来越限制和7 DIV TNT1免疫反应性最明显的增长轴突(图3 c)。这对应于总τ表达丰富的轴突,特别是在远端轴突,而其他神经域(黑色et al ., 1996数据没有显示)。有趣的是,垫接触还可以看到在树突7 DIV (图3 c箭头)。相比之下,在早期开发小过程缺乏TNT1免疫反应性(图3一箭头)。更成熟的神经元垫接触和pT205τ硝唑的特定点进行的轴突轴突穿越另一个或胞体(图3 d;补充图S1)。这些潜在的突触网站需要交付买下产权。有趣的是,活跃dp-GSK3β也似乎更加突出选择轴突穿越点(图4 b)。
图3。垫接触pT205τ定位变化,变得越来越限制通过神经发展。WT海马神经元培养2(A, B)7(C),或10 DIV(D)是TNT1彩色(红色)和/或pT205τ(绿色),肌动蛋白(phalloidin;洋红色),MAP2(白色)。在2 div TNT1免疫反应性是可见的细胞内的身体和最长的神经突。垫较少暴露于小流程和分支(一个箭头)。同样,pT205τ免疫反应性是均匀分布的最长的神经突和细胞内的身体而不是丰富小流程(B箭头)。7点div, TNT1免疫反应性是人体细胞中观察到最后最长的神经突(C箭头)以及一些小流程(C箭头)。由10个div,垫曝光和pT205τ是潜在的突触网站本地化。pT205τ和垫接触局部限制沿着轴突在axonal-axonal或子域axonal-cell身体过境点(D箭头)。无论是pT205还是TNT1免疫反应性是富含MAP2-positive树突(D箭头)。规模的酒吧年代:10μm(A, B, D)20μm(C)。
图4。活跃phospho-Ser9-GSK3β局限于发展中神经元的特定位置。WT海马神经元培养2(一)或10 DIV(B)被染色不活跃phosphor-Ser9-GS3β(绿色),活跃dephospho-Ser9-GSK3β(红色),和肌动蛋白(phalloidin)。在早期开发的点状的染色不活跃pGS3β可见沿着神经突生长而活跃的dp-GSK3β更有限的本地化(一)。在以后的发展,活跃dpGSK3β局限于特定的子域的轴突轴突穿越点(B箭头),以及在细胞体内。规模的酒吧:10μm。
3.2τ淘汰赛主要海马神经元受损轴突和树突分枝
健康的神经突结果依赖于有效的运输的蛋白质和细胞器生长锥(Pfenninger弗里德曼,1993;克雷格et al ., 1995;Futerman和银行家,1996)。此前据报道,主要来自τKO小鼠海马神经元受损的结果在文化(道森et al ., 2001),但这一发现并没有一致的不同动物模型(原田et al ., 1994;武井et al ., 2000)。确认和扩展这些先前的研究,τ淘汰赛神经元∼E16.5老鼠培养锁相环(补充图S2)或锁相环+层粘连蛋白(图5)生长基质。结果和神经元的形态分析微管蛋白免疫反应性后,24日,48岁,72或96 h在文化。24 h后,大多数WT神经元有实质性的结果包括一个主要的神经突明显比其他人长和一些神经突分支(图5一个;补充图S2A)。相比之下τKO神经元只最小的萌芽和分散微管蛋白染色(图5一个;补充图S2A)。总神经突长度的测量证实,τKO神经元显著减少增长仅在所有时间点分析当生长在锁相环(补充图开通)或锁相环+层粘连蛋白结合底物(图5 b)。同样的,最长的神经突的长度(突)τKO神经元明显小于WT神经元为每个计算和生长衬底(图5 d;补充图S2D)。
图5。τKO海马神经元受损的神经突结果和分支相比WT神经元。主要从WT和τKO小鼠海马神经元培养在保利-l赖氨酸+层粘连蛋白24、48、72、或96 h染色为β3-tubulin紧随其后。(一)WT海马神经元(电流-电压)进展通过已知的神经突阶段产物(弗莱彻和银行家,1989)。相比之下,τKO海马神经元神经突和复杂性产物(v-viii)低于WT神经元在所有时间点。蓝色:DAPI,白色:β3-tubulin。酒吧规模:50μm(B)主要从τKO小鼠海马神经元明显较短的总长度比WT神经元神经突结果从24 h(文化和文化继续96 h。(C)最长的主要神经突(突)明显缩短τKO海马神经元WT相比。(D)其他主要(树突)神经突的长度大大延长了WT海马神经元而τKO神经元在所有时间点。(E)主神经突的数量保持一致的文化从24 h - 96 h WT和τKO海马神经元和明显WT神经元在所有时间点。(F)WT海马神经元有一个整体的轴突和树突分支数量高于τKO神经元24 - 96 h的文化。(G)主要从τKO小鼠海马神经元明显短二、三级等效计算的神经突的长度比WT神经元文化。(H)WT海马神经元轴突分支数量有显著高于τKO神经元。个体神经元N = 96 - 119分析(见补充表2 & 3)。* * * *p< 0.0001,* * *p< 0.001,* *p< 0.01,*p< 0.05。
除了长的轴突产物,WT神经元也有更多的“其他主要探明”或树突时间点(图5 e;补充图S2E)。WT和τKO神经元,主探明仅略有增加的数量随着时间的24 - 96 h (图5 c;补充图S2C)和生长基质之间没有显著差异。但是在所有情况下,主大了WT神经突神经元的数量比τKO神经元(图5 c;补充图S2C)。最后,分支机构的数量和长度测量。经过24小时的产物,一些WT神经元已经多达10个分支机构,主要在最长的神经突,假定轴突(图5 f、H;补充数据S2F, H)。神经突分支的数量仍然显著高于对锁相环(WT神经元在每一个计算补充图S2F)和锁相环+层粘连蛋白生长基质(图5 f)。神经突分支也更大的总长度WT神经元相比τKO神经元在每个计算都由于更高的条数和更长的长度为每个分支(图5克;补充图S2G)。
总之,在初级文化τKO海马神经元发育不良在每个测量分析相比WT海马神经元。视觉上,τKO神经元大约2天背后WT神经元同行(图5一个;补充图S2A),证实了先前的研究显示τ对神经突结果很重要。
3.3受损神经突的τ淘汰赛主要神经元不能恢复hTau40-ΔPAD or-T205A
多个来源,τ是重要的神经突生长表明然而它的作用机制是未知的。暴露(τ)n端垫在生长锥(图2)在开发过程中海马神经元主要强烈表明,垫是参与这些神经元子域交付货物。如果是这种情况,那么神经突结果应该依赖的存在和接触垫。此外,以往的研究表明,垫接触可以由一个磷酸化残留T205 (莫里斯et al ., 2021),co-localization垫接触和pT205通过免疫荧光(图2;补充图S1)也表明磷酸化在这个渣是很重要的。测试的依赖神经突产物残留T205垫曝光和磷酸化,τKO神经元转染16 h与0.5μg全长hTau40-WT电镀后,hTau40-ΔPAD或hTau40-T205A。τ蛋白c端mCherry标记观察转染细胞。转染后细胞被固定72 h,在96 h文化,分析了产物微管蛋白免疫反应性(图6)。
图6。与hTau40-WT转染,但不是hTau40-ΔPAD hTau40-T205A,改善神经突τKO海马神经元的产物。主要从τKO小鼠海马神经元培养保利-l赖氨酸+层粘连蛋白转染16 h后电镀和培养进一步固定和染色β3-tubulin前72 h。(一)τKO 96 h后海马神经元的神经突有限结果1),但结果是改善与hTau40-WT转染后2)。相比之下,τKO海马神经元的转染hTau40-ΔPAD 3)或hTau40-T205A (iv)并不能提高神经突结果相比untransfectedτKO海马神经元。蓝色:DAPI,白色:β3-tubulin。酒吧规模:50μm。(B)的总长度增加了转染hTau40-WT(神经突p= 0.0014),但不是hTau40-ΔPAD (p= 0.963)或hTau40-T205A (p= 0.81)。(C)主要探明τKO神经元的数量略增加了转染hTau40-WT但没有达到意义(p= 0.1937)。hTau40-ΔPAD (p> 0.999)或hTau40-T205A (p> 0.999)转染不会增加主探明的数量。(D)轴突受损结果显著提高了转染hTau40-WT (p= 0.0005)。相比之下,转染hTau40-ΔPAD没有增加轴突产物(p= 0.944)。转染后hTau40-T205AτKO实际上显示不如untransfected神经元轴突产物(p= 0.0242)。(E)树突分枝也增加了转染hTau40-WT (p= 0.0005)。转染hTau40-ΔPAD (p> 0.999)或hTau40-T205A (p> 0.999)不会增加树突分枝。(F)的总数量的分支τKO海马神经元与hTau40-WT转染(p> 0.999),hTau40-ΔPAD (p= 0.424)或hTau40-T205A (p= 0.986)并没有增加。(G)轴突分支与hTau40-WT转染后的数量(p> 0.999),hTau40-ΔPAD (p= 0.093)或hTau40-T205A (p= 0.430)并没有增加。(H)的总长度τKO神经元轴突和树突分支并不是增加了转染hTau40-WT (p= 0.999),hTau40-ΔPAD (p= 0.698)或hTau40-T205A (p= 0.698)。所有的数据收集在96 h后文化。个体神经元N = 101 - 115(见分析补充表S4, 5)。* * * *p< 0.0001,* * *p< 0.001,* *p< 0.01,*p< 0.05。
转染的hTau40-WT显著增加τKO神经元的轴突产物培养在锁相环(补充图S3D)或结合锁相环+层粘连蛋白(图6 d)。相比之下,hTau40-ΔPAD或hTau40-T205A没有增加轴突的产物相比untransfectedτKO细胞(图6 d;补充图S3D)。有趣的是,τKO神经元培养在锁相环+层粘连蛋白和转染hTau40-T205A实际上减少了在文化比untransfected 96 h后神经元轴突的结果(图6 d)。这可能表明,在T205磷酸化是同样重要的额外下游通路以及接触PP1-GSK3β垫和激活。
转染hTau40-WT也增加了树突分枝的总长度比untransfectedτKO神经元(图6 e;补充图S3E)。对锁相环细胞生长,hTau40-ΔPAD转染树突分枝略有增加但仍不显著不同untransfected (补充图S2)。转染的hTau40-T205A没有增加树突分枝相比untransfectedτKO神经元在锁相环(补充图S3E)或锁相环+层粘连蛋白(图6 e)生长基质。以及影响产物长度,hTau40-WT转染的数量也增加了主要探明神经元生长在锁相环(补充图S3C)。也略有增加数量的初级神经元的神经突生长在锁相环+层粘连蛋白hTau40-WT转染后但没有达到增加意义(图6 c)。
的数量和长度和分支相比大大减少了τKO神经元WT神经元(图5;补充数据S3F-H)和转染hTau40并不影响树突和轴突分支的总长度(图6;补充数据S3G, H)。然而,转染hTau40-WT略有增加分支机构的总数在两个锁相环(补充图S3F)或锁相环+层粘连蛋白(图6 f)衬底和这一趋势可能持续,成为重要的在以后的计算。hTau40-ΔPAD或hTau40-T205A转染没有任何分支机构的数量或长度增加而untransfectedτKO神经元(图6;S3 F-H补充数据)。即使没有分支机构受影响,总神经突后产物长度大大延长hTau40-WT相比,转染non-transfectedτKO神经元(图6 b;补充图S3B)。总神经突的hTau40-ΔPAD或hTau40-T205A转染神经元没有明显不同于untransfectedτKO神经元(图6 b;补充图S3B)。
4讨论
之前我们实验室确定了磷酸酶激活域组成氨基酸最近,垫,τ的氨基端。接触的垫导致激活PP1-GSK3β信号通路导致抑制顺行脂肪(LaPointe et al ., 2009;Kanaan et al ., 2011)。研究已经证明,垫接触是一个早期事件在多个tauopathies硝唑与τ寡聚物和AT8免疫反应性(Kanaan et al ., 2011;Kanaan et al ., 2012;考克斯et al ., 2016;Kanaan et al ., 2016),但是否垫也有生理作用尚不清楚。顺行运输带我们提出的选择性抑制瞬态,特定站点曝光的氨基端垫,和激活PP1 / GSK3β信号级联,是选择MBO货物的交付机制对神经元轴突,因此重要发展。在本文中,我们建立了有选择性接触的垫在海马神经元发展网站的货物交付,与dephospho-Ser9-GSK3βpT205τ的本地化和活跃。此外,我们表明,τ垫接触和T205磷酸化功能作用在神经突的产物。
主要分析海马文化通过免疫染色显示板暴露在发展在特定神经生长锥等子域。在早期和后来发展时间点,TNT1观察免疫反应性神经突生长结束时和在生长锥的中央部分(图2 b, C, E类似活动GSK3β()Morfini et al ., 2002;Morfini et al ., 2004)。从我们实验室之前的研究得出的结论是,活跃GSK3β浓缩在生长锥通过使用总量和不活跃的phospho-Ser9-GSK3β抗体(Morfini et al ., 2002;Morfini et al ., 2004)。最近使用专门开发了抗体识别活动dephospho-Ser9-GSK3β(Grabinski Kanaan, 2016)我们能够确认先前的调查结果,dp-GSK3β是中部地区的局部生长锥(图2 a, D)以及细胞(图4)。
在早期发展(2 DIV), TNT1免疫反应性丰富沿着轴突的长度增长,但观察树突和轴突分支在低得多的水平(图3一)。由七个DIV,垫接触仅限于轴突的生长锥区域,但也可见一些,但不是全部,树突(图3 c)。这个时间在本地化的改变是显著的海马神经元在文化遵循一个典型的模式的产物。经过短暂的多极阶段,一个神经突开始迅速伸长而其他进程保持静止或略有收缩。大约第五天的文化小流程简历上伸长和收购树突形态(弗莱彻和银行家,1989)。没有TNT1免疫反应性在小流程2 DIV但外观7 DIV表明垫是专门暴露在积极神经突生长。而且这些结果表明,至少在早期发展阶段,接触垫的作用在发展轴突和树突。我们先前的研究发现,GSK3β优先磷酸化KLC2可与为的驱动蛋白重链亚型(KIF5A、B或C)形成了传统驱动蛋白复杂(Morfini et al ., 2002;DeBoer et al ., 2008)。因此,PP1 / GSK3β信号级联的下游垫接触会直接目标的一个子集顺行脂肪货物经由传统驱动蛋白包含KLC2亚型。已经提出KIF5汽车在轴突和树突(功能Setou et al ., 2002;Kanai et al ., 2004;Hirokawa et al ., 2009),尽管其他的研究已经发现,KIF5排除在树突(雅各布森et al ., 2006;Karasmanis et al ., 2018优先)和重组KIF5-GFP表达主要海马神经元局部轴突(醒来时,Hirokawa 2003)。传统的驱动蛋白被认为是参与运输需要通过神经元的线粒体和活性产物(期间尤其重要田中et al ., 1998;Iworima et al ., 2016;史密斯和盖洛,2018年)。那里也可以间接的行为PP1或GSK3β激活其他驱动蛋白马达。此外,GSK3β已知等在生长锥底物磷酸化stathmin 3和微管相关蛋白1 b (MAP1B)参与调节微管动力学(Trivedi et al ., 2005;Devaux et al ., 2012)。
在更为成熟的海马神经元(10 DIV),沿着轴突(垫接触成为有限域图3 d),没有TNT1 MAP2-positive树突的免疫反应性。板暴露在轴突的小区域的最突出的是交叉胞体或树突(图3 d)。这是值得注意的,因为这些子域可能是新生的突触的网站。这些流体结构形式迅速在axo-dendritic接触文化(Ahmari和史密斯2002年;Washbourne 2015)。有趣的是,蛋白质成分需要形成一个稳定的、成熟的突触在两类囊泡运输都显示暂停增加新生的突触(Ahmari et al ., 2000;埋葬和Sabo 2011)。此外,实验表明这暂停最有可能是由于泡类型应对共同的信号(埋葬和Sabo 2011)。Pre-synaptic膜蛋白,如synapsin-I SNAP25 syntaxin-1B已被证明是由传统运输驱动蛋白(Szodorai et al ., 2009)。这些结果表明,接触的垫和激活PP1-GSK3β可能促进交付新突触的突触前成分。
自氨基端垫只检测到特定的子域发展中海马神经元,因此,必须有严格的监管来控制其风险敞口。τ构象是监管通过磷酸化和我们也表明,τ磷酸化可以调节下游信号通路(Jeganathan et al ., 2008;Bibow et al ., 2011;Kanaan et al ., 2011;莫里斯et al ., 2021)。建立在数据莫里斯et al ., 2021我们证明pseudophosphorylation hTau40-T205E足以抑制顺行脂肪通过垫接触和GSK3β激活,我们探索T205磷酸化在初级海马神经元的定位观察类似定位板暴露在开发(图3;补充图S1)。GSK3β更广泛分布,但GSK3β的活性形式表现出类似TNT1浓缩在细胞区域和pT205 (图4)。pT205本地化的网站垫接触,加上以前的结果,支持假设的磷酸化T205与接触的垫在特定网站的发展。这个假说是T205磷酸化的进一步支持的动态。pT205迅速脱去磷酸在老鼠大脑溶解产物,超过50%的信号丢失在死后第一个60年代指示这是一个动态磷酸化网站(王et al ., 2015)。此外,与大多数τphosphoresidues pT205由PP1优先脱去磷酸(刘et al ., 2005)暗示可能会有负面反馈循环垫接触。这是基本的过度曝光垫与多个tauopathies (Kanaan et al ., 2011;Kanaan et al ., 2016;梳子和Kanaan, 2017)和6 dτ的过度表达,不能折叠的氨基端τ构造,主要在海马神经元轴突退化结果(莫里斯2021)。
垫的位置暴露和T205磷酸化在海马神经元特有的发展与我们的假设一致,监管的接触垫是一种机制驱动蛋白的特定买下产权交付。由于轴突运输是必不可少的神经突产物,我们调查的功能板暴露和T205磷酸化在τ淘汰赛神经元。正如前面所示(道森et al ., 2001),我们发现τ淘汰赛神经元有抑制副产物相比WT神经元(图5;补充图S2)。转染的全长hTau40-WTτKO海马神经元显著增加其轴突和树突分枝untransfected细胞(图6,补充数据S3D, E)。相比之下转染hTau40-ΔPAD或hTau40-T205A没有增加产物相比untransfectedτKO神经元(图6,补充数据S3D, E)。这些结果清楚地表明,暴露的氨基端垫在海马神经元发展对正常神经突的结果很重要。此外,磷酸化在T205似乎是必要的接触垫。树突的赤字和改善结果也支持垫接触的作用和T205磷酸化在树突生长锥被TNT1建议,pT205疣状。
有趣的是,τKO海马神经元也有赤字相比,轴突和树突分支WT神经元(图5;补充数据S2F-H)没有显著提高了hTau40转染(图6;S3 F-H补充数据)。然而,分支机构的总数量和总长度增加了hTau40-WT转染虽然没有达到意义。这似乎是由一个轻微的增加树突分支的长度从轴突分支的长度被转染不变(图6克;补充图S3G)。一个有限的分支数量和长度增加的原因可能是τ同种型用于转染。最长的同种型τ(hTau40;2 n4r)选择遵循从先前发表的实验(Kanaan et al ., 2011;莫里斯et al ., 2021)。然而,在老鼠,胎儿τ主要由0 n3r同种型直到出生后,在这段时间里表达逐渐开关4 r亚型(佐藤et al ., 2003)。此外,即使这个发育开关,2 n4r仅限于soma,不成为轴突丰富直到成年期(刘,Gotz 2013)。需要进一步的实验来探索神经突分支τ的功能,以及同种型特定功能的影响。
在活的有机体内,τ敲除老鼠似乎导致很少公开的赤字。最初只指出差异降低了微管的数量和密度无髓鞘的小脑平行纤维(原田et al ., 1994)。然而,更严格的测试表明,τ基因敲除小鼠在运动协调赤字以及在上下文恐惧条件反射学习障碍(Ikegami et al ., 2000)。相比之下,人类缺乏τ是涉及神经发育延迟。患者在17号染色体microdeletion q21.31,其中包含MAPT基因,显示学习困难在所有其他症状(Shaw-Smith et al ., 2006;Dubourg et al ., 2011)。急性击倒τ的老鼠也有显著的抑制神经突的表型结果在体外和抑制神经元迁移和树枝状发展在活的有机体内(卡塞雷斯和Kosik, 1990;卡塞雷斯et al ., 1991;萨丕尔et al ., 2012)。一些函数(τ)似乎MAP1B补偿的轴突和树突(MAP2DiTella et al ., 1996;武井et al ., 2000;刘et al ., 2019)。特别是,τ和MAP1B似乎协同作用的双基因敲除小鼠已经加剧了抑制轴突伸长和神经元迁移(DiTella et al ., 1996;武井et al ., 2000)。无论是MAP1还是MAP2包含垫,但是他们可能有类似的支架功能。例如,PP2A / Bα和菲英岛与脯氨酸丰富图案MAP2和τ(桑塔格et al ., 2012)。此外,灌注MAP2c到乌贼轴浆模型可以抑制顺行性脂肪,与τ垫,通过一个未知的机制(明沟布雷迪,未发表的数据)。我们实验室的一项研究发现,抑制Cdk5也可以导致激活PP1-GSK3β这可能代表一个独立的途径来调节货物交付在生长锥(Morfini et al ., 2004)。
总体结果提出了支持我们的假设,激活PP1 / GSK3β监管特定站点曝光的氨基端τ垫是一种机制等货物交付选择子域生长锥和新生在神经突突触,并从而重要结果。有效的脂肪是必要的神经元的开发和维护,和选择性交付的货物可能会涉及多个交叉机制。据报道,有局部控制PP1和GSK3β活动网站的货物交付但激活机制是未知的(de Waegh et al ., 1992;谢长廷et al ., 1994;Morfini et al ., 2002;Morfini et al ., 2004)。垫的接触代表一个在发展中神经元通路。
数据可用性声明
原始数据支持了本文的结论将由作者提供,没有过度的预订。
道德声明
动物研究是审查和批准的动物保健委员会,伊利诺伊大学芝加哥。
作者的贡献
SM和某人的构思和设计研究。SM收集和分析所有数据。SM和某人写和编辑的手稿。所有作者的文章和批准提交的版本。
资金
这项研究是由国家卫生研究院的基金R01 NS082730,一下R21 AG067772-01A1和τ财团的资助/雨水的基础。
确认
我们愿意承认并感谢尼科尔Mesnard-Hoaglin和本王的技术援助主要神经元细胞培养和免疫染色的优化。我们还要感谢Ming-Ying蔡提供他的专长与质粒克隆。
的利益冲突
作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。
出版商的注意
本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。
补充材料
本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fcell.2022.1023418/full补充材料
补充表S1|莫里斯和布雷迪和Tables.DOCX补充数据。
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关键词:τ蛋白磷酸酶1轴突运输快,驱动蛋白,GSK3β
引用:莫里斯SL和布雷迪圣(2023)τ磷酸化和板暴露在调节轴突生长。前面。细胞Dev。杂志。10:1023418。doi: 10.3389 / fcell.2022.1023418
收到:2022年8月19日;接受:2022年12月23日;
发表:2023年1月18日。
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Coralie Fassier法国INSERM U968研究所de la愿景版权©2023莫里斯和布雷迪。这是一个开放分布式根据文章知识共享归属许可(CC)。使用、分发或复制在其他论坛是允许的,提供了原始作者(年代)和著作权人(s)认为,最初发表在这个期刊引用,按照公认的学术实践。没有使用、分发或复制是不符合这些条件的允许。
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