原始研究的文章

前面。中国。糖尿病Healthc。,08 September 2022
秒。糖尿病和妊娠
卷3 - 2022 | https://doi.org/10.3389/fcdhc.2022.945768

西方食源性孕产妇微生物变化相关的微rna表达水平改变了狒狒胎盘和胎儿肝脏

卡梅伦y Sugino ^{1 __}

Ashok曼荼罗 ^{1 __}

雷切尔·c·詹森 ¹

Sunam高隆 ²

MaJoi特拉梅尔³

迈克尔·w·天³

理查德·s .刷⁴

詹姆斯·f·帕潘 ⁵

大卫·w·代尔 ³

Martin-Paul Agbaga ^4、6

雅各布·e·弗里德曼 ^1、7

玛莉索Castillo-Castrejon ^5、8

凯伦·r·Jonscher ^{1,9 *}

院长答:迈尔斯 ²

¹哈罗德汉姆糖尿病中心,俄克拉荷马大学健康科学中心,美国俄克拉荷马城,好吧,
²妇产科,俄克拉荷马大学健康科学中心,美国俄克拉荷马城,好吧,
³微生物学和免疫学,俄克拉荷马大学健康科学中心,美国俄克拉荷马城,好吧,
⁴眼科、俄克拉荷马大学健康科学中心,美国俄克拉荷马城,好吧,
⁵病理学系,俄克拉荷马大学健康科学中心,美国俄克拉荷马城,好吧,
⁶细胞生物学,俄克拉荷马大学健康科学中心,美国俄克拉荷马城,好吧,
⁷生理,俄克拉荷马大学健康科学中心,美国俄克拉荷马城,好吧,
⁸斯蒂芬森癌症中心,俄克拉荷马大学健康科学中心,美国俄克拉荷马城,好吧,
⁹生物化学与分子生物学、俄克拉荷马大学健康科学中心,美国俄克拉荷马城,好吧,

产妇食用高脂肪,西式饮食(WD)扰乱了孕产妇和婴儿肠道菌群和有助于免疫系统的发育编程和非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的后代。表观遗传变异,包括非编码microrna在胎儿和胎盘也印证这一风险。我们先前表明,孕期肥胖灵长类美联储WD导致的损失有益孕产妇肠道微生物和细胞代谢的调节异常胎儿肝脏和线粒体功能障碍,导致摄动产后免疫反应与加速非酒精性脂肪肝在少年的后代。在这里,我们调查之间的关联WD-induced孕产妇代谢和微生物的变化,没有肥胖,microrna的胎盘和胎儿肝脏基因表达变化。WD喂~ 8个月后,大坝体重相似,但表现出温和,系统性炎症(c反应蛋白升高和中性粒细胞计数)和血脂异常(增加甘油三酯和胆固醇)与大坝美联储控制饮食。孕产妇肠道微生物组是主要组成的Lactobacillales和梭菌属的,显著降低α多样性(P在WD-fed大坝= 0.0163),但没有覆盖社区的差异(P= 0.26)。0.9妊娠,mRNA的表达白细胞介素6和肿瘤坏死因子在孕产妇WD(随钻测量)暴露胎盘趋于上升,同时增加甘油三酯,促炎的表情CCR2,组织学证据mWD-exposed胎儿肝脏纤维化被发现。mWD-exposed胎儿的肝脏表达水平的mir - 204 - 5 - p和mir - 145 - 3 - p明显下调,而在mWD-exposed胎盘,mir - 182 - 5 - p和mir - 183 - 5 - p明显减少。值得注意的是,mir - 1285 - 3 - p表达式在肝脏和mir - 183 - 5 - p在胎盘明显与炎症和脂质合成途径相关基因,分别。Blautia和瘤胃球菌属明显与mir - 122 - 5 - p在肝脏,而Coriobacteriaceae和Prevotellaceae密切相关,mir - 1285 - 3 - p在胎盘;microrna与通路调节产后增长和肥胖。我们的研究结果表明,随钻测量变化的孕产妇微生物组,脂质代谢和炎症在肥胖和相关的表观遗传变异在胎盘和胎儿肝脏。这些变化可能是炎症,氧化应激和纤维化模式驱动非酒精性脂肪肝与代谢疾病风险的下一代。

介绍

非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是全球最常见的肝脏疾病。特点是简单的脂肪变性(肝脂肪过多),非酒精性脂肪肝可能发展为非酒精性脂肪肝炎(纳什)与炎症和纤维化,导致肝硬化和肝细胞癌的风险增加(1)。CDC估计> 1800万繁殖能力的美国人超重或肥胖,肥胖和孕产妇强烈与炎症和代谢紊乱的后代(2- - - - - -7)。令人担忧的是,在5学龄前儿童肥胖(18)和1/3的肥胖青年被诊断为非酒精性脂肪肝(9)。尽管有证据表明,产妇营养过剩造成不利影响代谢健康人类(10)和动物(11- - - - - -15)的后代,都有一个基本分子机制缺乏深入了解孕产妇膳食暴露胎儿免疫重组开发和非酒精性脂肪肝在子宫内,特别是在模型,反映了人类的状况。

胎盘作为母亲和胎儿之间的主要接口,允许养分和氧气传输支持胎儿的生长和发育。肥胖相关母胎炎症导致各种不良妊娠结果包括胎盘功能障碍(16,17)、子痫前期、神经发育(18),宫内生长受限(19,20.),早产(21,22)。调查慢性炎性环境的肥胖孕妇的胎盘显示增长两到三倍的常驻巨噬细胞(CD68 +和CD14 +)和促炎细胞因子的表达与胎盘从精益怀孕(23)。然而,胎盘炎症的根本原因尚不清楚。一个可能的机制是通过炎症代谢产物,如脂多糖,由微生物产生,达到更高的肥胖系统性水平(24),可以直接与胎盘toll样受体4 (25)。西式饮食的作用(WD)与母亲肥胖破坏胎盘功能和炎症状态还有待阐明,大多数孕产妇肥胖动物模型依赖一个WD达到并保持肥胖。

母亲怀孕期间肠道微生物的变化,影响产妇的饮食,母亲肥胖、妊娠体重增加过多,妊娠期糖尿病(GDM) (26- - - - - -28)。动物和人类的研究(29日- - - - - -32)支持孕产妇肠道微生物和细菌代谢物的作用在产妇肥胖(附带的病理生理变化33)、后代非酒精性脂肪肝(34,35),和婴儿炎性疾病(36)。WD-induced孕产妇肥胖与受损有关微生物和胎盘结构和功能的变化,与氧化应激和炎症伴随的子宫内环境(37- - - - - -39)。滋养层识别和应对细菌产品(40)和集成microbial-derived信号通过通路调节响应toll样受体或表观遗传修饰(41)。虽然机制的副产品肠道失调影响胎盘炎症/功能和胎儿炎症不是很好理解,减少有益细菌代谢物可能扮演一个角色。

新兴的研究解决产妇饮食和肥胖的协会与表观遗传改变签名和微生物功能的后代(13,42)。表观基因组由DNA和组蛋白修饰,产生遗传转录和细胞功能的变化(43)。表观遗传修饰的一种形式是小分子核糖核酸(microrna)。microrna很小,非编码rna结合的3 '非翻译蛋白质编码区mrna,降低或抑制翻译有针对性的mrna。在人类中,mir - 122、miR-34a miR-21,和miR-29a调节脂质代谢,氧化应激,炎症在肝脏,与非酒精性脂肪肝的病理生理学(至关重要的作用44- - - - - -47)。研究调查的影响,早期胎儿肝脏的microrna的变化是稀疏的;然而,使用大规模测序和狒狒通路分析胎儿肝、Puppala等人发现了11个microrna针对13基因代谢途径(三羧酸循环,氧化磷酸化和糖酵解),蛋白酶体和WNT /β-catenin信号(48)。在胎盘,microrna的表达水平受缺氧(49),产妇接触有毒代理人如香烟(50)和双酚A (51)和GDM (52)。在人类中,怀孕前体重指数升高与降低胎盘microrna的表达水平有关;这些差异被后代修改性和孕产妇妊娠期体重增加(53)。然而,研究调查产妇饮食之间的关联,短链脂肪酸(SCFAs),表观遗传修饰在胎盘和胎儿肝脏是缺乏。这里,我们利用成熟的橄榄狒狒(Papio导引亡灵之神非人灵长类动物(额定马力)模式的孕产妇WD消费调查孕产妇微生物的变化及其与胎盘和胎儿肝脏microrna的表达谱在非肥胖怀孕。

材料和方法

动物模型

所有实验利用狒狒进行符合动物福利法案制定的指导方针的住房和医疗实验室动物以及美国国立卫生研究院办公室实验室动物福利公共卫生服务政策人道关怀和使用实验动物。所有的动物都收到环境浓缩。所有实验按照和俄克拉荷马大学健康科学中心的批准机构动物保健和使用委员会(IACUC;协议302043 # 22 - 025啊)。

未生育过的女性橄榄狒狒(Papio导引亡灵之神;n = 11;4 - 7岁;青春期是~ 4 - 5岁)具有类似瘦身体分数被随机分为两个主要群体与类似的平均年龄和体重,考虑到社会分层。水坝被安置在饮食组(n = 5/6 /控制)持续时间的研究。标准控制饮食(CD)大坝被喂猴子食物饮食(5045年,厂家LabDiets,圣路易斯,密苏里州;30.3%的热量来自蛋白质,13.2%来自脂肪,56.5%来自碳水化合物)和WD大坝被喂以高脂肪、糖high-simple饮食(泰德灵长类动物的饮食,5 l0p厂家;18.3%的热量来自蛋白质,36.3%的热量来自脂肪,45.4%来自碳水化合物),匹配到CD中,微量元素和维生素,补充了连续访问高果糖饮料(100 g / L KoolAid™)。两组都提供相同的日常浓缩食物(水果和花生)。泰德饮食/高果糖喝被广泛用于研究的角色一个能量摄入过剩,大量饱和脂肪,高果糖饮食生理系统在额定马力(54,55),符合人类的改进算法。WD允许最初的3个月后收集的基线样品和适应WD,大坝是培育雄性,之前美联储CD。血液、粪便样本,和人体测量(体重和皮肤褶皱的总和)获得在氯胺酮(10 - 20毫克/公斤)和乙酰丙嗪(0.05 - -0.5毫克/公斤)镇静通过肌内注射。化学镇静后,头或隐静脉导管被抽血。0.6妊娠(G;项是妊娠183天~)狒狒禁食过夜。静脉葡萄糖耐量试验(IVGTT)下进行氯胺酮和乙酰丙嗪镇静和两个适当大小的静脉导管被放置到每个隐或头静脉,或组合,一个用于输注葡萄糖和一个用于静脉采血。基线抽血被从一个导管和50%葡萄糖静脉丸(0.5克/公斤体重)通过第二导管管理超过30秒。静脉血液中血糖测量时使用一个0,2、4、8、12、16、20、40分钟后葡萄糖输液。

母亲的血液分析

全血细胞计数(cbc)获得的大坝EDTA-anticoagulated全血样品。cbc包括分析对红细胞、白细胞计数(中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞),血小板和血红蛋白。产妇血清样本收集分析了0.6 G的c反应蛋白(CRP)使用一个hsCRP酶联免疫试剂盒(MP生物医学,梭伦,哦)根据制造商的协议分析了1:10 0血清稀释和il - 6使用一个旧世界猴白介素酶联免疫试剂盒(U-CyTech生物科学、荷兰)根据制造商的协议。产妇血清样本分析使用甘油三酸酯比色测定甘油三酯(TGs)工具包(开曼化工、安阿伯、MI)根据制造商的协议。高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白/低密度脂蛋白(LDL / VLDL)血清中水平量化样本的0.6 G禁食大坝使用EnzyChrom高密度脂蛋白和低密度脂蛋白/ VLDL化验用品(生物测定系统,海沃德,CA)。样本化验一根据制造商的指示。

剖腹产

在0.9 G,大坝使用异氟烷麻醉和胎儿被剖腹产交付。胎儿和胎盘重量了,胎盘和肝组织标本组织学或瞬间冷冻处理在液氮和储存在-80°C为后续分析。

肝脏组织学

胎儿左叶肝组织样本在10%福尔马林固定24小时存储在70% EtOH紧随其后。组织学是由OUHSC斯蒂芬森癌症组织病理学核心。总之,石蜡包埋,切片样本)和picrosirius红染色。用来从左叶肝在10月复合固定,切片,用福尔马林固定为5分钟,洗PBS。LipidSpot脂滴染色(Biotium, Fremont, CA)添加到部分和孵化20分钟。部分用PBS洗净,用DAPI复染色,安装使用VectaMount AQ水安装介质(向量实验室,伯林盖姆,CA)。幻灯片是可视化使用Cytation 5显微镜和Gen5成像软件(安捷伦,圣克拉拉,CA)。

胎盘免疫荧光

后马上胎盘在剖腹产,胎盘组织从每个子叶解剖:一半的每个样本瞬间冷冻和储存在-80°C,另一半在4%多聚甲醛固定48 h, EtOH转移到70%,石蜡包埋。薄片(5微米厚度)获得每150微米的石蜡块和放置在幻灯片。免疫荧光(如果)标签,选择部分允许共有四个部分每子叶至少150微米之间的部分。幻灯片在56°C,烤1 h deparaffinized和抗原检索了2100年猎犬仪器与R-Universal抗原决定基恢复缓冲区(电子显微镜科学,哈特菲尔德,PA)。检索后,幻灯片被封锁在5%正常驴血清1 h,然后主要抗体(MAC387 [anti-S100A9 + Calprotectin], Abcam,剑桥,英国)添加幻灯片和孵化16 h与加湿在4°C。幻灯片随后被允许平衡为1 h RT。二次抗体(驴anti-mouse免疫球蛋白g F (ab) 2 Alexa萤石594年,杰克逊ImmunoResearch西树林,PA)添加和幻灯片1 h,孵化,在RT,幻灯片复染色与DAPI和盖玻片使用5分钟前/挂载。幻灯片是可视化使用荧光显微镜(奥林巴斯BX43)和图像捕获使用CellSens成像软件(奥林巴斯)。四个150 x150微米图像被随机选中组织切片(700 x500微米)与选择之间没有重叠部分和巨噬细胞被研究人员数盲治疗组。巨噬细胞总总结了所有图片/胎盘和得分。

胎儿肝脏和胎盘组织分析

RNA提取胎儿肝脏(左叶)被迅速冻结样品使用Direct-zol RNA miniprep工具包(Zymo研究、欧文、CA))制造商的指示。1 ug的互补脱氧核糖核酸合成RNA使用iScript Supermix (Bio-Rad大力神,CA)制造商的指示。基因表达测定用实时qPCR PowerUp SYBR绿色主人混合QuantStudio 6乐器(热费希尔科学、沃尔瑟姆,MA)。结果归一化RPS9使用比较Ct(核糖体蛋白S9)方法。胎盘,qPCR进行类似于胎儿肝脏除了使用CFX96 rt - pcr检测系统(Bio-Rad大力神,CA)。胎盘结果归一化ACTB使用比较Ct方法。引物对qPCR所示补充表S1。胎儿肝脏TGs提取如前所述(32)和量化使用无穷甘油三酯试剂(热费希尔)标准化开始组织重量。

总RNA,包括microrna是隔绝瞬间冷冻胎儿肝脏(左叶)和胎盘组织(两个样本/胎盘从单独的子叶)使用一个miRNeasy迷你包(试剂盒,日耳曼敦,MD)制造商的指示。TaqMan MicroRNA化验(热费希尔)用于逆转录和实时qPCR (mir - 122 - 5 - p,化验ID 002245;mir - 204 - 5 - p,化验ID 000508;miR-34a-5p,化验ID 000426;miR-21-5p,化验ID 000397;mir - 183 - 5 - p,化验ID 000484;miR-29a-3p,化验ID 002112;mir - 185 - 5 - p,化验ID 002271;mir - 145 - 3 p试验ID 002149;mir - 1285 - 3 p试验ID 002822; miR-199a-5p, assay ID 000498; miR-182-5p, assay ID 000597). Reverse transcription was carried out using TaqMan MicroRNA Reverse Transcription kit (Thermo Fisher), an RT primer from a specific TaqMan MicroRNA Assay, and 10 ng total RNA following manufacturer’s instructions. The miRNA-specific cDNA templates were placed on ice and used immediately for qPCR or stored at -20°C for 1-2 days prior to use. Real-time PCR reactions were performed in duplicate using TaqMan Universal Master Mix II, no UNG (Thermo Fisher) and the corresponding TaqMan MicroRNA Assay following manufacturer’s instructions. Assays were performed on a QuantStudio 6 Real-time PCR System. Ct values were calculated and the relative miRNA expression levels were quantitated with the comparative Ct method and using miR-92a-3p (assay ID 000431) for normalization.

短链脂肪酸分析

冰冻的粪便(100 - 200 mg)被添加到200瓶继续μg / L的氘丁酸(内部标准),0.2克/毫升不₂阿宝₄和0.8 g / ml硫酸铵与磷酸(pH值调整到2.5)。外部标准和0.2克/毫升不准备₂阿宝₄,200年0.8 g / ml硫酸铵μg / L氘丁酸(内部标准),200年μg / L 2:0(醋酸),100μg / L握,和50μg / L的4:0 5:0,6:0 (pH值调整到2.5)。瓶都快封顶,积极激动。7890气相色谱仪配备7697顶空取样器,5975 c质谱检测器,DB-FATWAX UI 30 x 0.25 x 250列用于分析(安捷伦)。顶空取样器炉、循环和传输线温度举行50°C, 100°C,分别和110°C。瓶平衡时间是30分钟,注射时间是1分钟。瓶填充压力15 psi和循环最终压力为1.5 psi。循环平衡时间是0.05分钟。GC进口和MS接口是举行250°C。烤箱温度为2分钟举行120°C,增加在5°C /分钟到140°C,增加20°C /分钟到220°C,并为1分钟举行220°C。氦载气流动不断1.2 ml / min和分割比例为10:1。SCFAs被发现在SIM离子模式使用m / z值的43岁,45岁,60岁,63,73,74,77,87。大量的2:0,握,4:0,5:0,6:0测定比较外部标准。

微生物DNA提取和测序

从粪便中提取DNA从大坝采用DNeasy PowerSoil套装将按照制造商的说明(试剂盒)使用以下修改。整除的300毫克的粪便的体重,800年resuspendedμL CD1、解决方案和孵化60°C 10分钟。图书馆建设和DNA测序由OUHSC分子生物学实验室和血细胞计数研究。图书馆建设工作Nextera XT图书馆准备工具包(Illumina公司,圣地亚哥,CA)。V4地区16 s基因的目标使用地球微生物工程引物515 f / 806 r。样本编码复用,测序的Illumina公司MiSeq使用paired-end测序600周期MiSeq试剂盒v3 (Illumina公司)。

数据分析

孕产妇数据,胎儿肝脏TGs和qPCR数据之间的比较分析了CD并使用一个未配对,WD 2-tailed学生的t测试;意义被确定为P< 0.05。最初的原始微生物数据处理采用QIIME2 2019.10软件(56)。测序16 s rRNA原始fastq文件进口去复用双端读取phr 33分的。序列是修剪,质量过滤和去噪为扩增子的序列变异(asv)使用DADA2 (57)。asv然后对齐新创使用MAFFT (58)和结构化的系统发育树使用FastTree2 (59)。α多样性(例如,信仰的动植物种类史的多样性,香农)和β多样性(如加权UniFrac距离,Bray-Curtis)饮食组之间比较利用克鲁斯卡尔-沃利斯和PERMANOVA,分别。分类是分配给每个ASV使用sklearn-based朴素贝叶斯分类法分类器(6013)pre-trained绿色煤电_8辣子鸡参考数据库序列(99%61年)。线性判别分析效应大小,LEfSe (62年),评估原始分类丰富表显著不同的类群丰富实验的背景下组。的厚壁菌门来拟杆菌门比(F / B)相关孕产妇使用斯皮尔曼相关措施和Wilcoxon rank-sum测试用来测试F / B比值的差异饮食组。

变量选择方法:由于小样本大小(n= 11)和相对大量的比较变量大坝(11措施)和胎儿(63措施),我们执行至少绝对收缩和选择算子(套索)正规化(63年)利用技术的变量选择属性之间的意义在测试之前孕产妇和胎儿测量。简而言之,套索回归一个收缩术语(λ)适用于模型中的系数以提高(即。,减少模型的均方误差。这种类型的处罚可以降低一些的价值系数为零,消除他们从模型和提供的变量选择方法。要实现这个过程,我们使用R包glmnet (64年)。孕产妇和胎儿周围的措施标准化建设每个模型前的平均值和标准偏差。每个胎儿测量作为响应变量和孕产妇措施作为解释变量;我们包括母体之间的交互项措施为每个产妇和胎儿性测量模型中的。自套索正规化需要完整的数据,每个模型估计只使用与完整的数据样本(最小值n= 5,平均n= 7)和选择最好的λ值是基于最小均方误差的模型。孕产妇变量选择套索程序被运行在单变量方差分析模型对胎儿变量使用完整的数据集(n= 11),P值是编译和使用Benjamini-Hochberg罗斯福校正应用程序。类似的方法被应用于比较胎儿措施;然而,由于胎儿样本有完整的数据,只有四个胎儿措施分为三个独立的数据集:microrna(33措施,包括肝脏和胎盘),胎儿mRNA水平(27措施),和其他措施(胎儿体重,心脏重量,和肝脏TGs);胎儿的性别是包括作为所有模型的交互项。对比了胎儿microrna是使用肝microrna的措施作为响应变量和胎盘microrna的预测。分手后胎儿的数据集,我们进行以下比较:胎儿microrna与mRNA, microrna与其他措施,信使rna与其他措施;样本大小用于每个套索过程达到一个最低5,7点的中值比较。

套索正规化也用于变量选择比较孕产妇微生物群(n= 10)孕产妇和胎儿的措施。比较孕产妇孕产妇微生物的措施,我们利用R包mpath (65年拉索)执行过程使用负二项回归模型。短暂,微生物群分类分类家族和属水平和过滤,包括分类单元中至少50%的样品和达到至少1%的相对丰度。微生物群计数数据被用于输入默认值的套索glmregNB函数正规化,选择最好的模型使用贝叶斯信息准则。再次,只有成套数据中使用套索过程(n= 6)。变量选择对于每一个分类单元运行在一个单变量与R包质量(负二项回归66年)充分利用数据集(n= 10)。P值是编译和使用Benjamini-Hochberg罗斯福校正应用程序。套索模型构造仅使用完整的数据集,在统计数据上运行完整的数据集。比较胎儿措施的结果孕产妇微生物群丰度,我们使用arcsin平方根变换的微生物群的相对丰度数据(67年)作为婴儿预测措施。套索正规化是用来构建这些模型使用glmnet和单变量方差分析模型被用来测试意义如前款所述。样品尺寸用于套索正规化孕产妇微生物群与胎儿措施如下:胎儿microrna的,n= 8;胎儿mRNA,n= 6;和其他胎儿措施(体重、心脏重量,和肝脏TGs),n= 8。胎儿性别在这些模型作为一个相互作用的术语。

结果

WD诱发炎症在大坝、胎盘和胎儿和影响脂质代谢

时间(天)从起始的WD IVGTT (0.6 G)进行范围从276到480天(332±39 d);剖腹产的时间从起始WD (0.9 G)进行范围从324到535天(386.5±39 d)。尽管这期间WD /高果糖,0.6 G,在母亲的体重无显著差异(图1一个)或肥胖指数(和皮肤褶皱的厚度,图1 b)被观察到。这些发现符合那些Nathanielsz报告的实验室(68年,69年)使用一个类似的饮食和狒狒模型,证明实现孕产妇密苏里肥胖需要至少9 ~ 3年的WD喂食。尽管WD-fed大坝不发胖,血清c反应蛋白(图1 c)和中性粒细胞(图1 d)增加,无血清il - 6的变化(图1 e),指示性温和,系统性炎症反应WD之前达到肥胖。WD-fed大坝也表现出升高血清TGs (图1 f)。血清高密度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白(VLDL胆固醇显著高于在WD-fed大坝而CD-fed大坝;然而,没有观察到显著改变总胆固醇(图1 g)。血液的葡萄糖耐量测试并没有表现出显著的影响饮食(图1 h)。在一起,这些发现表明,相对较短的怀孕期间暴露在WD诱发重大系统性炎症和脂质代谢受损狒狒大坝前显著改变肥胖和胰岛素敏感性。

图1

图1WD-fed大坝展览在炎症和脂质代谢改变0.6妊娠。母亲的体重(一)的总和(Σ)皮肤褶皱作为衡量肥胖(B)。产妇血清c反应蛋白水平(c反应蛋白,C)从完整的血细胞计数、中性粒细胞计数(D)、血清il - 6水平(E)和甘油三酸酯(F)。胆固醇血红细胞的分析(G)和IVGTT分析(H)。n= 5 - 6 CD和nWD = 5。未配对2-tailed学生的t测试是用来测试的意义。*P< 0.05,* *P< 0.01。

鉴于炎症标记观察在WD大坝,我们进行免疫荧光在固定胎盘部分获得剖腹产用抗体MAC387标签浸润的单核细胞/巨噬细胞。我们观察到很少MAC387 +巨噬细胞在孕产妇CD (mCD)暴露胎盘(图2一个)。胎盘巨噬细胞浸润多变量的WD-fed水坝,与著名的3 5胎盘巨噬细胞明显同时在两个胎盘巨噬细胞存在相当与mCD-exposed胎盘(图2一个右面板)。表达的细胞因子/趋化因子(IL1B,白细胞介素6,肿瘤坏死因子,IL8)在胎盘组织(图2 b)是提高孕产妇WD(随钻测量)暴露胎盘相比,但是差异没有达到意义mCD-exposed胎盘。然而,这两个白细胞介素6(P= 0.08)和肿瘤坏死因子(P= 0.068)表现出趋势的意义。没有明显的胎盘病理总值(钙化,梗塞)观察相比,mWD-exposed mCD-exposed胎盘。

图2

图2WD暴露增加单核细胞浸润的胎盘和诱发胎儿肝脂肪变性和纤维化。代表图像在胎盘组织和免疫荧光定量(一)。红色箭头指向MAC387-labeled巨噬细胞(绿色)。蓝色DAPI染色。(B)使用qPCR mRNA的表达细胞因子在胎盘。ACTB用于参考。代表图像的组织学分析胎儿肝脏组织(C)他走时,picrosirius红(PSR)、LipidSpot,嗯在100年拍摄的。胎儿肝脏甘油三酯(TG)(D)并使用qPCR mRNA表达分析(E)与RPS9用于规范化。n= 4 - 6 CD和nWD = 5。未配对2-tailed学生的t测试是用来测试的意义。*P< 0.05,* * * *P< 0.0001。

我们下一个测试孕产妇是否接触WD影响胎儿肝脏健康。肝脏脂质在mWD-exposed胎儿肝脏组织学检查明显(图2 c,上面板)和验证了增加LipidSpot染色(图2 c通过TG分析,降低面板)和(图2 d)。Picrosirus红染色,纤维化的指示器,在mWD-exposed胎儿肝脏明显更明显(图2 c中间面板)。在炎症相关基因的mRNA表达(白细胞介素6)、纤维化(COL3A1)和单核细胞浸润(CCR2从WD-fed水坝)在胎儿肝脏升高(图2 d),虽然只CCR2表达式是重要的团体之间。总之,这些数据表明,随钻测量在子宫内促进TG存储、趋势增加炎症和纤维发生早期,非酒精性脂肪肝的标志/纳什胎儿肝脏的变化。我们还执行qPCR分析炎症的微分表达式(肿瘤坏死因子,CCL2,TLR4,NOS2;M1巨噬细胞)以及抗炎(IL10,TGFB1,PDGFA,IL12B;M2巨噬细胞)的基因。然而,我们的分析并没有显示在这些基因的表达显著差异mCD -和mWD-exposed胎儿(补充表S2)。

孕产妇WD大坝引发微妙的微生物群变化

在0.6 G,孕产妇粪便短链脂肪酸水平没有差异饮食对丙酸和丁酸盐,但增加乙酸负载WD-fed水坝的粪便(图3一)。使用16 s测序,我们发现产妇肠道微生物组是主要组成的Lactobacillales和梭菌属的团体之间,适度调整微生物组成(图3 b)。暴露在WD导致显著降低α多样性(图4一),但是没有全社区的CD和WD组之间的差异以β多样性(PERMANOVAP值= 0.26;图4 b)。我们比较不同的孕产妇F / B比饮食组和孕产妇措施,发现无显著关联(补充表S3,补充图S1)。比较微生物群丰度之间的饮食,粪便WD-fed水坝是丰富的氨基酸球菌属和非保密Betaproteobacteria从CD-fed水坝,而在较高的特征Anaeroplasmatales丰度(图4 c)。使用PICRUSt预测功能通路,我们发现11通路可能区分饮食对孕产妇肠道微生物的影响。WD-exposed微生物群预测浓缩的生物合成途径,如糖质新生和天冬氨酸、天冬酰胺合成,而CD喂养与铀浓缩有关鼠李糖生物合成的途径,乳糖/半乳糖退化,bacterial-specific生物合成的肽聚糖(葡萄球菌)和o抗原(大肠杆菌;图4 c)。

图3

图3短期暴露在WD诱发孕产妇SCFAs和微生物群的一些改变。(一)大量的粪便SCFAs。n= 5 /组。未配对2-tailed学生的t测试是用来测试的意义。* *P< 0.01。(B)肠道微生物丰度为每个示例中,聚集在订单水平。订单由不到0.5%总丰度显示为“其他”。

图4

图4(一)α多样性用信仰的系统发育多样性。物种丰富度的意义进行了测试使用克鲁斯卡尔-沃利斯检验(P= 0.02)。(B)PCoA任命显示加权Unifracβ多样性。百分比变化解释显示在每个轴(PC1: & PC2 35%: 16%)。距离加权Unifrac PERMANOVA意义(P= 0.26)。(C)Lefse直方图绘制显著富集的类群丰度(上情节)和生化途径(较低的情节)。n= 5 /组。

孕产妇WD改变胎盘和胎儿microrna的概要文件

越来越多的证据表明,microrna调解肠道microbiome-host分子通信(70年)。我们试图探索一套针对性的microrna的差异在胎盘和胎儿与母亲的饮食有关。我们选择microrna以前发现差异表达在胎儿肝脏研究狒狒的大坝是肥胖,以及microrna是由肠道微生物组(mir - 122 - 5 - p, mir - 204 - 5 - p,和miR-34a-5p) (71年- - - - - -74年在啮齿动物和人类)或与纳什(miR-21-5p和miR-29a-3p) (75年- - - - - -78年)。microrna的表达分析在胎儿肝脏组织(图5一个)显示的差别明显对这些mir - 204 - 5 - p和mir - 145 - 3 - p的表达在随钻测量曝光。在胎盘中,我们观察到的差别明显对这些mir - 183 - 5 - p和mir - 182 - 5 - p WD-fed组(图5 b)。在胎盘组织,mir - 199 - 5 - p(差别显示趋势对这些P= 0.057)。的表达水平mir - 183 - 5 - p, mir - 182 - 5 - p和mir - 199 - 5 - p被定向在胎儿肝脏和胎盘相似,就像表达的增加mir - 1285 - 3 - p。

图5

图5微表情分析。microrna的表达在mCD -和mWD-exposed胎儿肝脏(一)和胎盘组织(B)。n= 6 CD和nWD = 5。未配对2-tailed学生的t测试是用来测试的意义。*P< 0.05,* *P< 0.01。

微生物群之间的关联,microrna的代谢功能,和胎儿肝脏基因表达

我们首先分析了系统性的母体参数之间的关联和脂质代谢孕产妇微生物群和胎盘microrna (表1)。罗斯福校正后,只有非保密立克次体和非保密Verrucomicrobia明显,积极与孕产妇HDL和Desulfovibrionaceae与胎盘重量呈正相关。接下来,我们分析了系统性的母体参数之间的关联和脂质代谢和胎儿肝脏TG, microrna, mRNA水平(表2)。胎儿肝脏TGs与孕产妇TGs呈正相关,高密度脂蛋白,低密度脂蛋白(VLDL。罗斯福校正后,只有比较胎儿肝脏TGs和孕产妇的低密度脂蛋白(VLDL仍然显著。相比我们的下一个胎儿肝脏TGs胎儿肝/胎盘microrna和胎儿肝脏mRNA水平(表3);然而,罗斯福校正后,这些比较严重。在我们分析胎儿肝脏microrna的表达水平和信使rna,我们发现几个胎盘和胎儿microrna与标记相关的脂质代谢,氧化应激,炎症和纤维化(表4)。与肝脏相关的最常见的microrna的mRNA水平mir - 1285 - 3 - p。肝脏mir - 1285 - 3 - p是负相关的NFE2L2,ICAM1,VCAM1,但积极联系在一起白细胞介素6。胎盘mir - 1285 - 3 - p呈正相关NFE2L2和消极的FAP。罗斯福校正后,只有联系mir - 1285 - 3 - p和白细胞介素6信使rna是重要的,但其他几个协会倾向于意义(表4)。相比我们的下一个胎儿肝脏microrna的水平和相对丰富的孕产妇微生物群分类家庭层面,发现mir - 122 - 5 - p呈正相关Succinivibrionaceae(表5)。胎盘mir - 1285 - 3 - p呈正相关Coriobacteriaceae和Prevotellaceae。两个分类单元显示性别差异与胎盘mir - 1285 - 3 - p,男性仍然呈正相关(Coriobacteriaceaer2 = 0.57;Prevotellaceaer2 = 0.70),但女性显示没有联系这两个类群(r2 = 0)。罗斯福校正后,只剩下胎盘mir - 1285 - 3 - p显著相关Coriobacteriaceae,Prevotellaceae,他们的交互与性。胎儿肝脏mir - 122 - 5 - p和Succinivibrionaceae罗斯福修正后显示趋势协会(P< 0.1)。在属级,胎儿肝脏mir - 122 - 5 - p仍负相关Blautia水平,积极联系在一起瘤胃球菌属罗斯福后修正。没有其他属选择套索模型中包含的其他microrna的测量。

表1

表1关联的代谢比产妇微生物群和胎盘microrna的测量。

表2

表2之间的关联孕产妇和胎盘和胎儿肝脏测量特征。

表3

表3胎儿肝脏甘油三酯协会microrna与mrna。

表4

表4microrna和胎儿肝脏mRNA表达水平之间的关联。

表5

表5之间的关联孕产妇微生物群,胎儿肝脏和胎盘microrna,胎儿肝脏mRNA表达水平。

讨论

表观遗传模式在胎盘和胎儿造成西式产妇的饮食可能影响孕产妇肠道微生物促进NAFLD后代的发展;然而,这些关系是human-relevant模型中描述的差。我们的研究使用橄榄狒狒,大坝被喂以CD或WD前和怀孕期间,是第一个研究早期微生物群之间的关联,胎盘和胎儿microrna,母胎代谢失调。尽管WD喂~ 1年,大坝没有显示显著的体重增加或脂肪沉积,与类似研究狒狒一致(69年)和日本猕猴(79年),肥胖是2到3年的WD喂养后获得。引人注目的是,在没有肥胖,我们发现,随钻测量不利影响脂质代谢和炎症沿maternal-placental-fetal轴,相伴与降低mir - 182 - 5 - p和mir - 183 - 5 - p mWD-exposed胎盘与mCD-exposed胎盘。之前的研究在额定马力没有关注microrna在胎盘和胎儿肝脏功能的协会。老鼠的一项研究报道的角色mir - 183 - 5 - p在调解NF-κB信号和减少促炎细胞因子分泌(80年),这表明mir - 183家庭的潜在作用在调节胎盘炎症。我们发现mir - 183家族的胎盘表达水平降低(包括奥- 182 - 5 - p和mir - 183 - 5 - p)正相关与表达的非酒精性脂肪肝/ NASH-relevant基因在胎儿肝脏;这个家庭被证明减弱小鼠模型的病理生理学纳什(81年),因此可能是一种新颖的目标对未来机械的研究在我们的啮齿动物模型。我们还发现母亲的微生物群之间的重要关联和胎盘mir - 1285 - 3 - p,产后的microrna与促进增长与肥胖的母亲产下的婴儿(82年)。胎儿的肝脏WD-fed大坝显示增加脂肪变性和相关基因的表达水平升高在巨噬细胞浸润,炎症和纤维化。这些胎儿NAFLD指数增加伴随肝表达的差别与对这些mir - 204 - 5 - p和mir - 145 - 3 - p。我们和其他人已经表明,随钻测量促进氧化应激在子宫内重组巨噬细胞炎性“M1”式的表型。此前,mir - 204 - 5 - p, microrna的已知受肠道微生物(74年),据报道,参与“平方米”巨噬细胞极化抑制IL-6R信号在组织和细胞系(83年,84年)和mir - 145 - 3 - p改变IL-16信号在单核细胞(85年)。虽然我们的数据mir - 145 - 3 - p冲突与Puppala et al。(48大坝),在我们的研究是在一个前肥胖状态的状态。进一步的研究调查的机械作用mir - 204 - 5 - p和mir - 145 - 3 - p在促进肝脏炎症是必要的。

虽然机制还没有完全阐明,肠道微生物的影响发展的慢性炎症性疾病,如肥胖通过各种主机通道,包括调解主持人microrna的表达(86年)。母亲肥胖对后代的影响微生物以前描述的日本猕猴(31日,87年),但潜在影响产妇的微生物改变表观遗传标记在胎盘或胎儿是不确定的。短期WD-feeding在我们的模型中,产妇微生物群是由厚壁菌门,主要是Lactobacilliales,梭菌属的,细菌性的强烈参与整个肠道功能的维护和健康(88年,89年)。没有母亲的肥胖,我们发现几个产妇肠道微生物之间的关联和孕产妇血清TGs,高密度脂蛋白,低密度脂蛋白VLDL、和c反应蛋白,尽管F / B比率没有显著相关的任何母亲的措施。F / B比率被认为是高脂肪肥胖与饮食相关的标志和其他代谢紊乱在人类和动物模型(90年- - - - - -93年)。然而,最近的一次审查挑战这个想法和建议其他因素,包括不同的脂多糖和SCFA生产、研究方法和学科特点,以及背后的复杂病因肥胖和代谢紊乱,影响这种关系(94年)。F / B比率关系在额定马力的研究也是有争议的。一项研究首次报道更高的F / B比率高脂肪饮食相比,地中海饮食(95年),而另一个调查报告F / B比率较低额定马力高脂肪饮食与食物饮食(96年)。在我们群非肥胖,怀孕的狒狒,我们没有发现F / B之间的联系比在0.6 G和孕产妇的代谢参数测量,包括饮食组。

类似于我们的发现关联Desulfovibrionaceae丰度与胎盘重量的狒狒,属脱磷孤菌属与GDM丰富女性(97年,98年);值得注意的是,GDM与胎盘重量增加(99年)。我们发现胎盘mir - 1285 - 3 - p与产妇的肠道微生物群的丰度Coriobacteriaceae和Prevotellaceae,这两个与产后刺激(显示一个积极的关系82年)mir - 1285 - 3 - p表达式从男性胎儿胎盘,但在女性没有联系。这两种细菌新陈代谢家庭活跃肠道微生物组的成员。mir - 122占70%的microrna成人肝脏和在监管过程中发挥作用的先天免疫(One hundred.),肝细胞的增殖和分化(101年)、脂质积累和胆固醇代谢(102年)。我们发现一个微分关联胎儿肝脏mir - 122 - 5 - p和两个产妇肠道属,Blautia和瘤胃球菌属,在那里Blautia消极与mir - 122 - 5 - p和瘤胃球菌属积极与mir - 122 - 5 - p。据我们所知,我们是第一个报告之间的联系孕产妇微生物群和胎儿肝脏microrna的表达。其他研究只调查了肠道微生物之间的关系和microrna在肿瘤组织内,报告负关联Blautia和肿瘤等microrna miR-20a miR-21, mir - 96, mir - 182, mir - 183和mir - 7974 (103年)和一个积极的协会和mir - 484 (104年),在肿瘤发生过程中发挥作用和细胞凋亡(105年)。有趣的是,最近的一篇论文报道,由肠病原体引起的感染导致肠道炎症通过mir - 122的异常表达和miR-21 (106年)。另一项研究发现细菌型均匀化和Phascolarctobacterium都有效负相关和mir - 122 - 5 - p在2型糖尿病患者的血清(73年)。然而,间接证据支持我们的研究结果表明,产妇Blautia可以帮助调节胎儿肝脏脂质代谢通过mir - 122表达未知的机制。例如,减少Blautia丰富了有关儿童肥胖和肠道炎症(107年),Blautia物种丰度与降低相关内脏脂肪积累在人类成年人(108年)。相反,瘤胃球菌属与内脏脂肪积累呈正相关(109年)和消极与mir - 484 (104年),建议瘤胃球菌属和Blautia有反对影响microrna与胎儿脂质积累和肿瘤发生有关。决定mir - 1285 - 3 - p和mir - 122 - 5 - p程序肥胖和非酒精性脂肪肝的早期生物标志物可能由产妇属等Blautia和瘤胃球菌属为未来的探索是一个重要的途径。

而CD-fed水坝,WD-fed大坝dyslipidaemia展出,其特点是低密度脂蛋白胆固醇和升高TGs。然而,基于IVGTT 0.6 G,这些大坝没有显示胰岛素抵抗指数。这些发现支持短的观察et al .,其中年轻(5 - 6岁)雄性狒狒美联储WD(富含单糖和饱和脂肪酸)8周展出/ VLDL水平升高高密度脂蛋白和低密度脂蛋白胆固醇和TGs,体重没有变化或血糖(110年)。短等人还指出重大影响炎症指标,增强CD14 +单核细胞趋化性以及显著增加血液中性粒细胞(110年)。我们同样发现WD-fed大坝温和,系统性炎症,以c反应蛋白水平升高,中性粒细胞计数增加,符合一些细胞因子变化的概要文件是加剧了母亲的肥胖。这些观察表明,upregulation至少一些炎性项目在怀孕期间的饮食本身。

我们发现的巨噬细胞数量增加的趋势在WD-fed水坝的胎盘是暗示增强chemoattraction孕产妇胎儿单核细胞/ Hofbauer单核细胞或细胞胎盘,或激活目标胎盘的母体外周单核细胞,与先前的发现是一致的单核细胞启动和增强单核细胞趋化性喂养8周的WD(雄性狒狒110年)。外周单核细胞从肥胖怀孕高架趋化因子受体的表达和增强显示迁移能力(23)。此外,胎盘居民CD14 +和CD68 +单核细胞(巨噬细胞)两到三倍增加肥胖的妊娠(23,111年)。以前,弗里亚斯和他的同事们指出增加胎盘炎症细胞因子表达和胎盘梗死灶在日本猕猴模型慢性WD和孕产妇肥胖(112年)。我们没有具体地址单核细胞启动在当前的研究中;然而,我们注意到mRNA的表达肿瘤坏死因子和IL8信使rna在高架mWD-exposed胎盘,符合WD-induced胎盘炎症的“启动”(结合招募巨噬细胞)。我们也没有发现显著的胎盘病理总值(钙化,梗塞)相比,mWD-exposed mCD-exposed胎盘。

我们的小说研究有几个优点包括我们用橄榄狒狒的平移模型发育编程。优势在啮齿动物,狒狒类似于人类妊娠期持续时间、胎座式(血性绒毛膜型monodiscoid),单例出生、荷尔蒙和社会行为。另外,我们的模型允许我们解决WD独立于孕产妇肥胖的作用未生育过的女性。本研究的一个缺点是小样本大小,这限制了我们可以从我们的分析结论。在产妇达到肥胖,狒狒模型Puppala等人显示趋势增加肝脂质积累和更严重的脂肪变性,组织学检查评估胎儿纳什(没有进展48)。这与我们的研究结果与Wesolowski et al。(12McCurdy)和et al。(79年)在胎儿的肥胖的日本猕猴WD-fed水坝有更高的肝TGs与线粒体功能受损,增加纤维发生相关,而纳什等人证明是肝门静脉周的局部区域(113年)。

与使用有针对性的分析,我们发现Puppala等人使用非目标化芯片的方法,发现mir - 145 - 3 - p调节肝脏从狒狒胎儿暴露于母亲的肥胖和与SMAD4的下降;他们另外报道增加mir - 182 - 5 - p和mir - 183 - 5 - p (48)。我们的研究结果是一致的与观测之前报道在肥胖的日本猕猴微分响应在大坝被发现高脂肪饮食,允许隔离成胰岛素敏感和胰岛素抵抗组(114年)。产妇胰岛素抵抗(TGs升高,胰岛素和体重增加)导致激活新创脂肪生成的和炎性通路在肝的后代在1岁(114年)。此外,Elsakr等人表明,长期WD喂食,多个饮食开关,和年龄增加和平价增加胰岛素抵抗在大坝(115年)。大坝在我们的研究中,接受一个相对短期暴露在WD,没有胰岛素抵抗并没有显著的体重增加与匹配CD-fed大坝;虽然影响我们观察到胎儿肝脏的温和,他们引人注目的鉴于产妇风险敞口有限。

我们认为,肥胖的发病之前,一个WD开始几个月前在其摄动引起孕产妇妊娠和维护脂质稳态和影响孕产妇肠道微生物群组成。产假代谢参数和孕产妇的肠道微生物群与胎儿肝脏microrna的表达和mRNA标记的脂质代谢,氧化应激,炎症,建议产妇的饮食,没有肥胖,对表观遗传调控具有重要影响胎儿和婴儿的健康。

数据可用性声明

在这项研究中提出的数据集可以在网上找到存储库。库的名称/存储库和加入号码可以找到(s)如下:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/839382 (BioProject)。

道德声明

动物研究回顾和批准俄克拉荷马大学健康科学中心机构动物保健和使用委员会。

作者的贡献

JP摩根富林明,KJ, DM导致概念和设计的研究。KS,点,RJ MC-C, KJ导致写初稿的手稿。SG,摩根大通和DM收集孕产妇数据。点,RJ SG,医学博士和RB进行实验。KS,太,和弟弟进行微生物和关联分析。DD, M-PA、摩根富林明和DM导致监督的研究。所有作者的文章和批准提交的版本。

资金

资助这项研究受到了哈罗德·哈姆基金会/长老会医院基金会拨款20211471 (KJ DM、摩根富林明,摩根大通,DD, M-PA)和国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所,格兰特R01-DK128416(摩根富林明)。

确认

我们感谢OUHSC斯蒂芬森癌症组织病理学核心,支持部分由美国P20GM103639 NCI P30CA225520,肝脏组织学。我们感谢OUHSC实验室分子生物学和血细胞计数研究核心库建设和测序。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

出版商的注意

本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。

补充材料

本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fcdhc.2022.945768/full补充材料

引用

1。Pierantonelli我Svegliati-Baroni g .非酒精性脂肪肝病:纳什的基本发展从非酒精性脂肪肝发病的机制。移植(2019)103 (1):e1-e13。doi: 10.1097 / tp.0000000000002480