抗生素的影响在体外表达tetracycline-off结构和性能的果蝇suzukiifemale-killing菌株

介绍

基因控制策略引入可控不育或致命性昆虫种群已经开发在一些昆虫,包括农业害虫和人类疾病向量(Harvey-Samuel et al ., 2017;Alphey Bonsall, 2018)。这些策略往往模仿昆虫不育技术的原理(坐),这释放出大量的radiation-sterilized昆虫抑制或消除目标害虫的数量(Knipling 1955;克拉森Vreysen, 2021)。与古典坐方法使用野生型菌株和遗传性别检测菌株(gss)由古典遗传学对于大规模生产,策略,如释放昆虫携带一个显性致死(RIDL)基因和转基因胚胎性别检测系统(苔丝)现代基因工程技术的优势。他们生成的昆虫菌株携带荧光基因标记(s)能够促进一个发布的监控程序和使用致命的基因杀死昆虫在特定阶段(黑客et al ., 2021)。此外,tetracycline-off (Tet-off)系统是用于那些RIDL和苔丝菌株控制致命的基因的表达,并允许人口维护。

的制约性Tet-off系统是基于四环素反式激活因子之间的相互作用(tTA)蛋白质和四环素响应元件(混乱关系),可以拦截了春节或其衍生品如强力霉素(阿霉素)(戈森Bujard, 1992;焦点和Hillen, 2003)。当春节不存在,tTA激活TRE-linked效应基因的表达,这是成功了黑腹果蝇(贝洛et al ., 1998)。介绍可控的杀伤力,细胞毒性或pro-apoptotic基因与混乱关系来生成一个Tet-repressible RIDL系统黑腹果蝇(海因里希和斯科特,2000;托马斯et al ., 2000)。这是进一步的发现tTA本身可以作为一个效应基因构建一个自动调整循环,导致tTA的积累(龚et al ., 2005)。这样的过度tTA通常杀死昆虫在发育后期阶段,如后期幼虫或蛹,虽然它背后的真正致命的机制仍然是未知的(永福et al ., 2007;蚂蚁et al ., 2012;李et al ., 2014;外耳et al ., 2016)。对于苔丝,从cellularization基因用于驱动tTA推动者,它激活一级(fs) pro-apoptotic基因表达并杀死所有雌性昆虫在胚胎或早期幼虫阶段由于诱导细胞凋亡。苔丝菌株等tephritid果蝇的生成角膜炎性,Anastrepha suspensa,答:ludens (Schetelig和处理程序,2012 b;Ogaugwu et al ., 2013;Schetelig et al ., 2016等),以及calliphorid绿头苍蝇Lucilia cuprina和Cochliomyia hominivorax(燕和斯科特,2015;燕et al ., 2020 b;外耳et al ., 2020),它可以降低饲养成本的控制程序。像苔丝一样,一级RIDL也可以通过使用一个fs-promoter生成tTA或者一个fs-spliced效应基因的基因内区(托马斯et al ., 2000;傅et al ., 2007;金et al ., 2013)。那些female-killing(颗)策略可能导致清一色的版本中,这是更有效的比叫cazuza版本的程序(坐瑞et al ., 2004;Schliekelman et al ., 2005;弗朗茨et al ., 2021)。

一颗策略使用Tet-off系统,监管机构春节起着决定性作用的性别检测效率和应变健身。例如,改造昆虫致死率是直接关系到春节衍生品的浓度(托马斯et al ., 2000;角和威默,2003年)。致命的阶段也依赖于春节的时间删除(龚et al ., 2005;Schetelig et al ., 2009;燕和斯科特,2015),致命的表型可以扭转再次通过添加春节(角和威默,2003年;Schetelig et al ., 2016)。而低浓度的春节不足以抑制绑定tTA和混乱关系之间产生的杀伤力,高浓度的春节显示有害影响昆虫健身(Schetelig et al ., 2009;Schetelig和处理程序,2012;燕和斯科特,2015;外耳et al ., 2020)。我们之前生成转基因颗菌株利用Tet-off系统发现翼果蝇(果蝇suzukii;双翅目,果蝇科),一场毁灭性的果蝇,最近成为高度侵袭性(Asplen et al ., 2015;多斯桑托斯et al ., 2017)。Tet-off构造V229用于生成这些颗菌株包含一个胚子果蝇suzukii零基因调节tTA(司机盒)和sex-specifically拼接pro-apoptotic基因藏^Ala4(效应盒式)消除女苍蝇。而最有效的颗应变消除女性的后代在胚胎阶段如果春节只有美联储在父母一代幼虫,其他菌株杀死了大部分的女性在晚期(Schetelig et al ., 2021)。这是猜测,春节可以母体遗传来的,关掉胚胎死亡率(角和威默,2003年;Schetelig et al ., 2009;Schetelig和处理程序,2012;燕et al ., 2017)。在这里,我们生成一系列Tet-off结构包含相同的驱动器盒式V229和报告基因盒EGFP-NLS和DsRed-CAAX由2中的肽。通过测试Tet-off记者结构在体外和d . suzukiiWT或颗菌株在活的有机体内,我们的目标是调查1)抗生素如何调节Tet-off构造的表达在细胞层面,2)抗生素如何影响下一代动态发展和生存,和3)抗生素是否会抑制或延迟我们颗菌株具有不同的工程杀伤力转基因活动。

方法和材料

昆虫饲养

的果蝇suzukii野生型(WT)美国应变和转基因线保持在25°C,湿度55% - -60%在12 l / 12 d光周期(Schwirz et al ., 2020;Schetelig et al ., 2021)。WT-USA应变被饲养在一个不需抗生素的饮食,和转基因菌株保存在相同的饮食补充100μg /毫升春节(热费希尔科学)。

质粒构建

Bicistronic基因磁带包含EGFP-NLS(或DsRed-NLS)和DsRed-CAAX(或EGFP-CAAX),由一个2肽分离(DrosCV-2A或TaV-2A),从V220被切除_pBXLII_attP_PUb-AmCyan_PUb-DsRed-NLS-DrosCV-2A-EGFP-CAAX-SV40,V221_pBXLII_attP_PUb-AmCyan_PUb-DsRed-NLS-TaV-2A-EGFP——CAAX-SV40,V222_pBXLII_attP_PUb-AmCyan_PUb-EGFP-NLS-DrosCV-2A-DsRed-CAAX-SV40,或者V223_pBXLII_attP_PUb-AmCyan_PUb-EGFP-NLS-TaV-2A-DsRed-CAAX-SV40(Schwirz et al ., 2020),用于替换V206 DsRed-NLS的向量_pXLBacII-attP-PUb-AmCyan_Dsnullo_DsRed-NLS-SV40(燕et al ., 2020 a)在Bsu36I MluI限制网站,生成V355_pBXLII_attP_PUb-AmCyan_Dsnullo-DsRed-NLS-DrosCV-2A-EGFP-CAAX-SV40,V356_pBXLII_attP_PUb-AmCyan_Dsnullo-DsRed-NLS——TaV-2A-EGFP-CAAX-SV40,V357_pBXLII_attP_PUb-AmCyan_Dsnullo-EGFP-NLS-DrosCV-2A-DsRed-CAAX-SV40,V358_pBXLII_attP_PUb-AmCyan_Dsnullo-EGFP-NLS-TaV-2A-DsRed-CAAX-SV40,分别。同样,切除bicistronic基因盒从V220 V221, V222或V223被用来替代效应基因盒Dshid^Ala4-CctraF在向量V229_pBXLII_attP_PUbAmCyan_Dsnullo-tTA-SV40_TREhs43-Dshid^Ala4-CctraF-SV40(Schetelig et al ., 2021)生成V359 Bsu36I和MluI限制网站_pBXLII_attP_PUbAmCyan_Dsnullo-tTA-SV40_TREhs43-DsRed-NLS-DrosCV-2A-EGFP-CAAX-SV40,V360_pBXLII_attP_PUbAmCyan_Dsnullo-tTA-SV40_TREhs43-DsRed-NLS-TaV-2A-EGFP-CAAX-SV40,V361_pBXLII_attP_PUbAmCyan_Dsnullo-tTA-SV40_TREhs43-EGFP-NLS-DrosCV-2A-DsRed-CAAX-SV40,V362_pBXLII_attP_PUbAmCyan_Dsnullo-tTA-SV40_TREhs43-EGFP-NLS-TaV-2A-DsRed-CAAX-SV40,分别。

细胞培养实验

细胞转染和计算进行了如前所述(燕et al ., 2020 a;Schetelig et al ., 2021)。简单地说,果蝇施耐德2 (S2)细胞生长在施耐德heat-inactivated中含10%胎牛血清(Hi-FBS)和1%的青霉素和链霉素closed-capped烧瓶没有有限公司₂在25°C。Xfectin转染试剂(豆类),1μg质粒DNA,和春节或阿霉素(阿尔法蛇丘)为0.1,10,100,500,或1000μg /毫升(相应的命名春节- 0.1,Tet-10,春节- 100,500年春节,春节- 1000,阿霉素- 0.1,Dox-10,阿霉素- 100,阿霉素- 500,和阿霉素- 1000)被用于瞬时转染。13毫米TC盖玻片(Sarstedt)放置到每个24-well板便于成像。转染是停在刷新菜500µL施耐德的介质含有青霉素和链霉素Hi-FBS 10%和1%。细胞被孵化∼18 h在25°C在4%多聚甲醛固定15分钟和洗涤短暂显微镜之前与PBS。使用M205FA转染细胞成像显微镜(徕卡微系统)和过滤集CFP AmCyan(436/20例;em。480/40), EGFP YFP(510/20例;安全域。560/40),TxRed(545/30例;em。620/60), GFP-LP叠加(425/60例;em。480)。 Fluorescent cells were counted in ImageJ (Fiji) using the automated cell count function. The raw images were converted to an 8-bit standardized format (threshold 30) and inverted before a watershed was applied to separate any cells in direct contact. The ratio of green or red to blue cells was calculated. To evaluate the effects of antibiotic treatments on cell viability, cells were grown with Tet or Dox at a certain concentration as mentioned previously without plasmid DNA. After incubation, the live cells were counted using a TC20 automated cell counter (Bio-Rad).

ELISA(酶联免疫吸附试验)试验

antibiotic-supplemented饮食喂养果蝇幼虫和成人阶段(L + / +),或者只在幼虫阶段(L + /−)。对于后者,蛹和ddH收集和清洗₂不需抗生素瓶O两次转移。测试父系或母系的影响,新出现的男性和女性是交叉和WT伴侣1 - 2周。F1代饲养在不饮食。然后,100个鸡蛋(0 - 6 h组)和10个成年女性(1天)从每个交叉收集作为ELISA测试样品(Elabscience生物技术)。此外,10 WT成年女性(1天)不需抗生素和春节- 100收集包含饮食正面和负面的控制,分别。三个生物复制用于每个交叉和控制。测量400µL三氯乙酸溶液(1%)和珠子(赖氨酸矩阵D散装,猫。6540 - 434年MPbio,法国)被添加到样品管,和组织使用Precellys 24均质机均质(20年代在6000 rpm)。样品管在4000 g离心10分钟在室温下。然后,上层清液(27.5µL)与调整缓冲区(82.5µL)混合,和50µL混合物的使用进行分析。稀释标准溶液(1.0 ppm)根据制造商的指示。 A measure of 50 µL of diluted standard solution and sample mixture was added per well of the pre-coated 96-well microtiter plate in duplicate; 50 µL of the antibody working solution was added to each well, and the plate was covered with a lid, gently oscillated for 5 s, and incubated with shading light at 37°C for 30 min. After incubation, the microplate wells were washed six times with 250 µL/well of washing buffer, 100 μL/well of streptavidin–horseradish peroxidase (HRP conjugate) was added, and the plate was incubated at 37°C for 30 min in the dark. Then, the plate was washed again as described previously, and 50 μL of each substrate reagent A and B was added sequentially per well. After incubation at 37°C in the dark for 15 min, the reaction was stopped by adding 50 μL/well of stop solution. Optical density (OD) at 450 nm and 630 nm of each well was measured as reference wavelength (TECAN microplate reader). The concentrations (ppb) were calculated as the OD value measured at 630 nm subtracted from that measured at 450 nm. The absorbance percentage was calculated using the following formula: absorbance (%) = A/A0 × 100% (A: average absorbance of the standard solution or sample; A0: average absorbance of 0 ppb standard solution). The average absorbance value from duplicate wells was added to the standard curve. The concentration calculated from the standard curve was multiplied by 8 (the dilution factor for the pretreatment of tissue/egg samples according to the manual) for the final concentration of the samples.

生物实验

评估抗生素治疗对飞行的影响生存和发展时间(从胚胎到成人),表明抗生素的饮食补充美联储WT-USA苍蝇,和成人交叉如前所述。总共收集了100个卵细胞,dechorionated之前将他们转移到不需抗生素瓶。Dechorionation是由淹没蛋为50%漂白剂溶液(Dan Klorix,高露洁,汉堡,德国)3.5分钟。然后,鸡蛋与蒸馏水冲洗三次,消除潜在的漂白剂残留。开发时间(天)的数量和由此产生的雄性和雌性都记录下来。鸡蛋没有dechorionation在类似的方式进行控制。测试的抗生素治疗女性颗菌株的杀伤力,春节的饮食- 100或阿霉素- 100是美联储V229_M4f1杂合的幼虫。收集蛹如前所述,新出现的雄性和雌性(< 4 h)分别保持在不需抗生素瓶1 5或10天前他们与WT伙伴了。这使得不同时期对抗生素降解的苍蝇。苍蝇是每日转移到一个新瓶tetracycline-free饮食9天(10瓶总)。荧光和荧光F1成年人(< 24小时)从这些10瓶是性感的和统计。 Meanwhile, the 1-day-old V229_M4f1 flies were crossed, and the offspring were reared and measured similarly, except that food with Tet-100 or Dox-100 was used throughout the experiments as controls. To assess the female survival, the V229_M4f1 larvae were fed with a diet containing Tet-100, Dox-100, or Dox-250, and the F0 adults were crossed on an antibiotic-free diet as described previously. The F1 transgenic females were collected every day in separated vials until no more females emerged. The females in those vials were counted every 2 days before transferring to a new vial (antibiotics-free) until all flies died. Meanwhile, the newly emerged F1 transgenic and WT males were counted to evaluate the male production under different antibiotic conditions. To verify the transgenerational effect of antibiotics, the diet with Tet-100 was fed to the V229_M8f2 heterozygous larvae, and the F0 and F1 transgenic females were crossed with WT males as described previously. The newly emerged F1 or F2 transgenic flies were sexed and separated into antibiotic-free food vials (20 flies per vial). These flies were counted every 2 days before transferring to new vials until 40 days or all flies died. The WT flies from antibiotic-free diet were counted similarly as the control. Here, three biological replicates were carried out for all the experiments.

统计数据

统计分析进行了使用SigmaPlot (v14.0)。差异绿色/蓝色或红色/蓝色细胞比率,飞发展或生存不同的治疗,抗生素浓度(ELISA检测),或男性生产不同交叉分析单向方差分析(方差分析)和方法(有些是平方root-transformed)分离使用Student-Newman-Keuls, Holm-Šidak或者邓肯的方法。差异之间的女性杀伤力WT,转基因后代不同antibiotic-treated母亲或父亲配对进行了分析t以及。不同的雌性后代的存活率antibiotic-treated母亲和父亲使用z检验进行了分析。

结果与讨论

春节和阿霉素监管Tet-off构造的表达在体外

我们从四个以前描述的推动者果蝇suzukiicellularization基因,包括零,serendipity-α(sry-α),瓶颈(bnk),慢得一塌糊涂(大满贯)。的Dsnullo启动子调控最强的DsRed-NLS基因表达在黑腹果蝇S2细胞(燕et al ., 2020 a)。我们之前也产生piggyBac向量包含bicistronic基因盒的EGFP-NLS(或DsRed-NLS)和DsRed-CAAX(或EGFP-CAAX)是由一个2中的肽(DrosCV-2A或TaV-2A) (Schwirz et al ., 2020)。bicistronic基因盒的监管黑腹果蝇polyubiquitin(DmPUb)启动子,果蝇suzukii改变了这些piggyBac向量显示全身绿色和红色荧光(Schwirz et al ., 2020)。在这里,我们生成的一系列piggyBac构造的bicistronic基因盒的直接控制之下Dsnullo启动子(V355-V358)或由响应的混乱关系的元素Dsnullo占有tTA (V359-V362) (图1一个)。

果蝇S2细胞转染V355-V358显示微弱的绿色荧光,没有红色荧光,不管EGFP-NLS的位置或DsRed-NLS 2肽(图1 b)。这些细胞也表现出亮蓝色荧光的DmPUb启动子(图1 b)。检测不到红色荧光的可能是由于相对较弱的活动Dsnullo启动子的DmPUb启动子和安全域的成熟时间更长。比EGFP T3蛋白(贝维斯•格里克,2002)。早些时候在体外研究表明,tTA司机和混乱关系致命的组合效应组件,但不是一个单独的组件,介导高效抗生素缺席时细胞死亡(Schetelig和处理程序,2012;Schetelig et al ., 2021)。同样,细胞转染V360或V362(用人TaV-2A)显示强烈的绿色和红色荧光(图1 b)。这表明一个强有力的表达诱导引发的基因盒bicistronic绑定的Dsnullo监管tTA的混乱关系和高效的蛋白质翻译由TaV-2A。另一方面,细胞转染使用V359和V361(用人DrosCV-2A)显示弱或中度表达EGFP-NLS和DsRed-NLS (图1 b)。这表明的乳沟活动时低于TaV-2A DrosCV-2A bicistronic盒放置混乱关系之后。DrosCV-2A和TaV-2A之前用于co-express包括两个不同的pro-apoptotic基因收割者,头对合缺陷(藏),严峻的。S2细胞死亡化验表明,可以显著提高杀伤力的二进制表达式相比单一表达式pro-apoptotic基因(Jaffri et al ., 2020)。在这里,我们的观察表明,TaV-2A可能优于DrosCV-2A使用Tet-off多个不同的致命的基因的表达系统。

弱者的表达报告基因在V359 (DsRed-NLS_DrosCV-2A_ EGFP-CAAX)可能是由于相对于DrosCV-2A安全域的位置。发现翻译是低效率的动态安全域在上游比下游2肽(王et al ., 2019)。此外,细胞成像V361和V362显示膜完整性的损失(图1 b),这表明安全域骨料破坏细胞壁。我们发现对细胞有害的影响在体外和在活的有机体内当overexpressing安全域。与膜标签CAAX T3 (Schwirz et al ., 2020)。具体地说,转基因果蝇suzukii表达DsRed-CAAX显示广泛的膜起泡和纯合子是致命的。因此,向量包含DsRed-CAAX可以用来生成条件致命的毒株。

自V360 V362表现出强烈的表达报告基因在没有抗生素在场,他们选择在响应分析这些基因的抑制春节或强力霉素治疗(图1 c)。V222和V356 bicistronic盒式的规定DmPUb和Dsnullo分别促进剂,也用作控制,因为它们不包含Tet-off组件,因此不应该应对抗生素治疗。因为所有的构造有一个测试DmPUb-AmCyan盒,细胞显示蓝色荧光表明这些细胞转染成功。那时红色或绿色细胞的数量与蓝色细胞的数量显示相对的安全域或EGFP的表达,通过控制Dsnullo启动子或混乱关系。当使用V222没有抗生素,春节- 100或阿霉素- 100转染,绿色和红色细胞比率(蓝色相关的细胞)的54.1% -25.3%,-66.4%和23.4%。绿色或红色细胞在这些治疗的比率没有显著差异(p> 0.05,单向方差分析)。同样,V356,绿色和红色细胞比率在2.6% - -7.8%和0.0% - -0.1%的范围,分别在这些治疗无显著差异(p> 0.05,单向方差分析)。因此,报告基因的表达水平在V222和V356独立于抗生素治疗。另一方面,绿色和红色细胞的比率V362分别为11.9%和35.3%,分别抗生素时缺席。这些比率显著降低0.1%和2.5% (p< 0.05,单向方差分析),分别在100年春节礼物。这表明V362春节100μg /毫升浓度有效拦截tTA和混乱关系之间的绑定,从而抑制了记者的基因表达。自从DsRed-CAAX V362破坏细胞壁的完整性(图1 b),有可能是细胞被这样的不利影响和不计入分析。

由于不利影响DsRed-CAAX TaV-2A细胞和高分裂活动,V360 (DsRed-NLS_TaV-2A_EGFP-CAAX)是用于进一步的实验存在剂量依赖的相关性。没有质粒DNA,治疗没有抗生素,春节- 0.1,Tet-10, 100年春节,春节- 500,阿霉素- 0.1,Dox-1,活细胞生成和Dox-10 > 70%,而与春节- 1000治疗,阿霉素- 100,阿霉素- 500,和阿霉素- 1000活细胞减少到47%,60%,33%,和27%,分别为(补充文件S2)。这表明,高剂量的抗生素减少细胞的可行性。活细胞转染V360从不同的抗生素治疗是进一步成像和计算。绿色/蓝色细胞的比率V360当没有抗生素(68.8%图1 c),类似于V222相应比例。添加春节- 0.1,Tet-10, 100年春节,春节- 500或阿霉素- 0.1显著降低绿色/蓝色细胞10.9% - -31.4%的比例(p< 0.05,单向方差分析)。没有绿/蓝细胞比率之间的显著差异在这些治疗方法(p> 0.05,单向方差分析)。添加春节- 1000、Dox-10阿霉素- 100,阿霉素- 500,或阿霉素- 1000的比例进一步降低绿色/蓝色细胞0.5% - -9.0%,远远低于从春节0.1治疗(p< 0.05,单向方差分析)。与此同时,红/蓝细胞的比例为43.0%时没有抗生素,显著高于V222 (p< 0.05,单向方差分析)。添加春节或阿霉素浓度显著降低测试红/蓝细胞比例降至-9.9% (1.5%p< 0.05,单向方差分析)。没有显著差异的红/蓝细胞比率在这些治疗方法(p> 0.05,单向方差分析)。可能细胞比率从高剂量治疗,如春节- 1000,阿霉素- 100,阿霉素- 500,和阿霉素- 1000不显示的整体表达记者磁带,因为更少的细胞是可行的与其他治疗方法相比(补充文件S2)。这也许可以解释为什么这些高剂量治疗没有进一步减少以显著的方式表达。

自从翻译效率可能阻碍通过将安全域2肽和蛋白质域之前需要一个较长的成熟时间比EGFP (贝维斯•格里克,2002;王et al ., 2019),绿/蓝细胞的比率可能是一个更好的参考bicistronic盒式的表达水平比红细胞计数。结果从绿/蓝细胞比率在体外化验集体建议如下:1)的表达Tet-off构造是敏感的抗生素治疗因为春节或阿霉素含量低(0.1μg /毫升)有效地降低了荧光细胞;2)高水平的春节或阿霉素(500年或1000年μg /毫升)被要求得到记者的最大抑制基因表达;3)阿霉素表现出整体效率高于春节在镇压记者基因表达;4),而Dsnullo启动子本身介导低报告基因活动(绿色/蓝色细胞的低比率从V356), Tet-off系统使用相同的启动子tTA记者基因表达增加类似于使用一个强大的水平DmPUb启动子(从V222绿/蓝细胞的比率)。

喂养的春节果蝇suzukiiWT苍蝇显示不同的影响发展和后代的生存

春节在100μg /毫升(春节- 100)是常用的后方的虫株杀伤力由Tet-off控制系统(龚et al ., 2005;Schetelig et al ., 2009;蚂蚁et al ., 2012;Schetelig和处理程序,2012;Schetelig和处理程序,2012 b;金et al ., 2013;燕和斯科特,201510点),春节μg /毫升(Tet-10)或降低了足以维持的致命菌株黑腹果蝇和c .性(角和威默,2003年;Schetelig et al ., 2009;李et al ., 2014;阿帕德海耶et al ., 2022)。在一个坐得控制程序使用转基因雌雄鉴别菌株基于Tet-off系统,发布前的最后一代将转向non-Tet饮食产生清一色的人群。雌雄鉴别菌株的改造与杀伤力,春节通常是提供给成年人,并养育后代没有春节将触发设计杀伤力(海因里希和斯科特,2000;托马斯et al ., 2000;傅et al ., 2007)。菌株与胚胎工程杀伤力,春节应该只提供给幼虫但不是成年人减少父母的春节,会抑制早期的杀伤力的后代(Schetelig和处理程序,2012;Schetelig和处理程序,2012 b;燕和斯科特,2015)。这里,父母春节影响后代的健康使用我们WT-USA应变进行了测试。为了避免任何可能的春节从父母的苍蝇,鸡蛋收集来自不同dechorionized使用bleach-based方法治疗。通过应用non-antibiotic条件和dechorionation (L /−−_decho),开发时间(从鸡蛋到成人)的女性和男性后代是16.1和16.5天,分别是与那些(17.7和16.8天,女性和男性后代,分别)从non-antibiotic条件,但是没有dechorionation (L /−−_intact)。相比“L−−”处理,喂养的幼虫和成虫阶段Tet-10 (Tet-10_L + / +),喂养春节- 100只幼虫阶段(春节- 100 _l + /−),喂养春节- 100的幼虫和成虫阶段(春节- 100 _l + / +),和喂养春节- 100只雄性(春节- 100 _l + / + _M)或雌性(春节- 100 _l + / + _F)雌性的发育时间推迟到22.2,21.7,20.2,23.9,和21.7天(p< 0.001,单向方差分析;图2一个)。同样,这些治疗男性后代的发育时间推迟到22.7,20.1,20.3,24.4,和22.1天(p< 0.001,单向方差分析)。另一方面,没有显著差异在女性或男性后代的生存治疗涉及F0兄弟姐妹,如“L−/−_intact,”“L−/−_decho,”“Tet-10_L + / +”,“春节- 100 _l + /−,”和“春节- 100 _l + / +”尽管抗生素治疗(p> 0.05,单向方差分析;图2 b)。然而,治疗包括摘要,包括“春节- 100 _l + / + _M”和“春节- 100 _l + / + _F”显著降低他们的后代的数量(p< 0.05,单向方差分析;图2 b)。

的发展和生存(从鸡蛋到成人)果蝇suzukii为饲养在很大程度上取决于变量如温度、湿度、和饮食(温克勒et al ., 2020)。总结从多个研究表明,在温度接近24或25°C,但是不同的湿度和饮食、发育时间在10 - 13天,成活率在55% -85% (温克勒et al ., 2020)。non-antibiotic条件下,发育时间在16 - 17天,因此长相比温克勒et al .,可能由于湿度,饮食和/或处理差异。然而,只喂养春节父母或父母的雄性或雌性后代的开发时间延迟3.6 - -7.9天(图2一个)。这建议一些父母的影响诱导的春节治疗成人和/或影响产妇的春节。检测抗生素的存在对苍蝇和他们的后代,ELISA进行基于春节抗体。分析检测到34.8 ng / g春节成年女性,美联储在100年春节的幼虫和成虫阶段(补充图S1)。然而,抗生素的鸡蛋从不同的治疗方法,包括不同的抗生素(春节或强力霉素),不同浓度(100,或250μg /毫升),不同治疗阶段(幼虫或成人),和治疗雄性或雌性,计算和比较non-antibiotic控制(补充图S1;p> 0.05,单向方差分析)。这样的水平(0.5 - -3.4 ng / g)也低于或接近检出限(2.4 ng / g)的酶联免疫试剂盒。结果表明,无论是抗生素没有存入鸡蛋被父母,或酶联免疫试剂盒不适合检测抗生素果蝇鸡蛋。

尽管所有涉及抗生素治疗延迟发育时间在下一代(图2一个),他们中的大多数并不影响生存(飞图2 b)。的控制程序d . suzukii使用昆虫菌株携带Tet-off系统,这些结果将意味着预发布昆虫生产一代不应该负面影响的春节饮食喂父母的一代。有趣的是,穿越Tet-treated苍蝇和未经处理的伴侣导致严重的后代数量减少(图2 b)。因为喂养春节父母双方都应该有更强的影响(如果不一样)对后代的性能相比只喂养春节父母中的一位,不太可能春节治疗父亲或母亲的后代数量的减少造成的。果蝇物种是出名的选型交配,描述了个体与他人选型交配的现象类似的环境诱变表型(罗宾逊et al ., 2012;Najarro et al ., 2015)。我们还观察到强烈的选型交配不同d . suzukii人群在我们实验室(数据未显示)。这样的选型交配可能促进个体间性不情愿从antibiotic-treated和未经处理的数量。有可能从这样的十字架并不收集一些鸡蛋受精(即使苍蝇交叉> 1周),因此不会孵化。另一方面,显示所有治疗不影响后代生存,兄弟姐妹从相同的人口被用于交叉,因此雌性更有可能。报道了选型交配坐应用程序作为一个障碍对瓜实蝇Hibino Iwahashi, 1991;小山et al ., 2004)。因此,使用antibiotic-supplemented mass-rearing人口之间的选型交配饮食和目标d . suzukii人口没有或有限的接触抗生素应该追究任何基因控制策略的实现基于antibiotic-fed系统。一个有用的工具,这样的目的是sperm-marking应变可以用来监控(选择性)交配特定人群(艾哈迈德et al ., 2019;燕et al ., 2021)。

喂阿霉素F0苍蝇抑制F1女性杀伤力d . suzukii颗应变V229_M4f1

在在体外研究使用Tet-off结构,应用高水平的春节或阿霉素(500或000μg /毫升)可以最小化效应基因的表达(图1 c)。然而,这种治疗方法对细胞生存能力(有严重的负面影响补充文件S2)以及健身的d . suzukii苍蝇在活的有机体内(Schetelig et al ., 2021)。因此,他们可能不会考虑实际使用。早期的研究表明,春节的数量需要抑制Tet-off system-mediated杀伤力受到昆虫和某些转基因菌株的活动。在春节100μg /毫升是常用的如前所述,在其他物种和Tet-off系统,更高的浓度高达200μg /毫升需要完全抑制杀伤力(谭et al ., 2013;外耳et al ., 2020)。在更高浓度(300μg /毫升),昆虫的健康c .性和Anastrepha suspensa严重影响(Schetelig et al ., 2009;Schetelig和处理程序,2012)。因此,我们选择了100年和250年μg /毫升浓度对于大多数实验测试。的果蝇suzukii颗应变V229_M4f1以前产生的生殖系使用向量V229转换_pBXLII_attP_PUbAmCyan_Dsnullo-tTA-SV40_TREhs43-Dshid^Ala4-CctraF-SV40(Schetelig et al ., 2021)。V229_M4f1应变显示适度的杀伤力和杀害女性大多在蛹和成人阶段当春节不是礼物。这里,我们美联储100年春节或阿霉素- 100 V229_M4f1幼虫分离新出现的男性和女性,并越过他们在不同年龄和WT伴侣non-antibiotic食物。此前,观察抗生素降解RIDL应变(OX513A)的黄热病蚊子埃及伊蚊(柯蒂斯et al ., 2015),可能由于昆虫的新陈代谢或绑定大量的春节tTA高浓度的蛋白质在RIDL生产系统。因此,苍蝇交叉在一个老年将通过降低大量的抗生素后代由于退化。因为杂合的V229_M4f1苍蝇交叉,一半的后代是WT 1:1性别比例(图3),而另一半是转基因果蝇(杂合的),性别比例受到父母的抗生素。以前,穿越V229_M4f1男性与WT女性non-Tet饮食产生转基因后代组成的女性只有14.2% (Schetelig et al ., 2021)。春节- 100用在这里的时候,不管F0性别和年龄、转基因成人的女性比例在14.6% - -24.5%的范围,明显低于WT在每个交叉(p< 0.05,配对t以及)(图3一)。因此,喂养春节- 100 F0苍蝇没有拯救女杀伤力F1。使用阿霉素- 100时,大部分的女性的转基因果蝇的百分比在31.9% - -41.3%的范围,不是明显不同于那些苍蝇WT (p> 0.05,配对t以及)(图3 b)。这些观察表明F1女性杀伤力镇压,可能由于一些Dox-induced父母的影响和/或继承了阿霉素的作用。唯一的例外是交叉使用10-20-day-old V229_M4f1雄性,这再次生产转基因后代分组的成年的话性别比例(女性比例为16.4%),表明阿霉素退化速度在男性或男性的贡献少的阿霉素比雌性后代在这个年龄。当F0和F1代都保持在春节或阿霉素的饮食,没有观察到的女性杀伤力转基因F1苍蝇。

为d .腹,春节μg(10 - 1000 /毫升)成年人抑制Tet-off system-mediated胚胎杀伤力,虽然阿霉素是更有效的在相同的浓度(角和威默,2003年)。在c .性,阿霉素不是春节100μg /毫升成年苍蝇完全抑制胚胎死亡率(Schetelig et al ., 2009)。与此同时,fsRIDL应变的疟疾蚊子按蚊stephensi,不到10μg /毫升的春节幼虫是不足以完全营救雌性的不会飞的表型(Marinotti et al ., 2013)。为埃及伊蚊OX513A应变、喂养1μg /毫升阿霉素幼虫完全救了蛹的杀伤力,不会飞的表型,这是比春节更有效(100倍柯蒂斯et al ., 2015)。在这里,我们表明,阿霉素,但不是春节,d . suzukiiF0幼虫导致F1(压制女性的杀伤力图3)。这些结果表明,阿霉素比春节更有效的抑制分子drosophilid, tephritid和蚊子。有趣的是,对埃及伊蚊OX513A,成年男性或女性接受50或100μg /毫升金霉素只产生很少的成年后代(柯蒂斯et al ., 2015),这表明抗生素没有传递给后代或者他们继承了但无法抑制工程杀伤力。由于OX513A应变的杀伤力是基于tTA的积累能够杀死蚊子幼虫阶段(永福et al ., 2007;柯蒂斯et al ., 2015),它是可能的,金霉素继承但退化,因此不能绑定和禁用tTA绑定在稍后的阶段。另一方面,在early-lethal系统d .腹和c .性基于embryonic-specific推动者,父母的抗生素被怀疑的可能原因抑制胚胎死亡率(角和威默,2003年;Schetelig et al ., 2009)。

喂养春节或阿霉素F0母亲长寿F1女幸存者生成V229_M4f1颗压力

在先前的研究中,几个果蝇suzukiifemale-killing线产生一些成年女性当父母的男性用抗生素喂养幼虫阶段,但是幸存者很快去世了(Schetelig et al ., 2021)。例如,女性的杀伤力在应变V229_M41f1达到100%后第一天出现(1天),而对于应变V229_M37f2 V229_M39m1,它在第三天达到100%。然而,对于压力V229_M4f1,女性杀伤力只有调查第一天但不超越阶段的早期研究。这里,我们计算V229_M4f1女性的存活率,源自antibiotic-treated(在幼虫阶段)的母亲或父亲。春节- 100添加到饮食时,5%和0.4%的女性相关治疗父亲活了下来,直到天2和4出现后,分别从治疗明显低于母亲(p< 0.05,z检验)(表1)。所有女性来自Tet-treated父亲去世之前6天,而三天女性从Tet-treated母亲一直延续到6和一女到28天。阿霉素- 100应用时,3%的女性从对待父亲活了下来,直到第二天,所有死在第四天,在这些天存活率明显高于(21.4%和5.8%)被发现在使用治疗母亲的十字架(p< 0.05,z检验)。阿霉素- 250应用的时候,没有女性对待父亲活了下来,直到第二天,而18岁女性对待母亲幸存下来的这一天,一个女性直到43天。

看来线V229_M4f1杀死女性通过发展,和一个完整的外显率的致命的表型可以实现在成年阶段时只喂养抗生素的父亲。另一方面,母亲喂养抗生素可能负责“逃脱者”的致命系统存活到成年阶段。对待母亲可能比别人更多的抗生素分子加载到一些鸡蛋,所以他们更加抵抗致命的系统。因此,策略如fsRIDL或苔丝,产生男性人口,可能比bi-sex致命的系统更有利,不消除女性释放的一代。几个蚊子释放项目控制结合bi-sex致命RIDL菌株的雌雄鉴别过程机械去除大多数女性(哈里斯et al ., 2011;卡瓦略et al ., 2014)。然而,对于昆虫没有一个有效的雌雄鉴别方法,bi-sex致命的系统需要仔细评估产妇抗生素的外显率的影响造成的效果。

喂养春节或阿霉素F0苍蝇显示不同的效果在F1 V229_M4f1男性生产压力

同样的,我们也算雄性源自antibiotic-treated V229_M4f1杂合的母亲或父亲。在所有治疗过,春节- 100父亲产生最多(262±51)的男性成年子女,这是类似于WT (p= 0.410,单向方差分析)。相比之下,阿霉素- 250母亲生产的最低数量的男性(68±19),显著低于从所有其他的十字架(p< 0.05,单向方差分析;表2)。此外,所有产生更少的男性相比,对待母亲和Dox-treated父亲WT十字架(p< 0.05,单向方差分析),这表明抗生素残留与治疗伤害男性生存在发展。更具体地说,转基因雄性的数量从阿霉素- 250美联储杂合的母亲和父亲明显低于从春节- 100美联储的母亲和父亲,分别为(p< 0.05,单向方差分析)。与此同时,阿霉素- 250 WT男性兄弟姐妹的春节- 100没有显著差异(p> 0.05,单向方差分析)。这些观察表明,转基因文件更敏感的男性生存增加剂量的阿霉素比WT苍蝇,可能由于健身转基因的成本。男性的生产是一个重要的参数评价昆虫菌株是否适合一个坐的程序。结果表明,喂阿霉素d . suzukii颗菌株在更高浓度可能会降低男性的生产。

喂养春节F0母亲推迟了致命影响的一代V229_M8f2颗压力

这是认识到父母的抗生素可能抑制杀伤力与pro-apoptotic基因相关的活动或表达水平(角和威默,2003年;Schetelig et al ., 2009;燕和斯科特,2015;燕et al ., 2017)。后者进一步受到的位置影响转基因(Schetelig et al ., 2016;外耳et al ., 2020;燕et al ., 2020 c)。可能我们以前观察到的低女性杀伤力一些V229行是由于低或中度活动pro-apoptotic进一步抑制基因的父母春节(Schetelig et al ., 2021)。因此,我们选择线V229_M8f2显示最低的女性杀伤力(32.7%)在七V229线路前继代寿命试验研究。同样,100年春节是喂F0幼虫,F0和WT雄性或雌性F1交叉non-antibiotic食品。我们发现的存活率F2男性在第11天,21日和31日分别为65.0%,53.3%,和45.0%,分别,没有显著不同于男性WT (p> 0.05,单向方差分析)。同时,雌性F1的存活率在第11天,21日和31日分别为88.3%,68.3%,和26.6%,分别从WT雌性没有显著不同于(p> 0.05,单向方差分析)。然而,大多数F2的女性死于第三天,表示26.7%的存活率,显著低于F1女性(91.7%)或WT女性(95%)(p< 0.05,单向方差分析)。这就像致命的F1代成年阶段,我们观察到在大多数V229行(Schetelig et al ., 2021)。此外,所有F2雌性死亡19天,说明完整的外显率的杀伤力可以实现这条线后一个额外的一代后抗生素治疗。

先前的研究也报道说d .腹菌株携带Tet-off-mediated fsRIDL系统,喂养10μg /毫升的父母春节是高效100μg /毫升春节在F1的压制女性的杀伤力。然而,后者推迟一代女性杀伤力(阿帕德海耶et al ., 2022)。纯合子的菌株是稳定保存最近开发转基因雌雄鉴别菌株d . suzukii使用pro-apoptotic基因Dmhid^Ala5或Dsrpr饮食与致命的效应器20μg /毫升春节(李et al ., 2021)。因此,低剂量的春节而不是高剂量可能是首选果蝇在这种实验物种。这将提供一个更好的评估向诱导杀伤力来自不同菌株通过最小化的影响抗生素。

结论

遗传害虫防治策略如RIDL或苔丝,一个合适的Tet-feeding计划,感动地和有效地控制mass-rearing致命的系统是至关重要的应用程序和现场发布程序。因为这些致命的系统可能会漏水的由于不足或退化的春节不完全抑制致死基因的表达(托马斯et al ., 2000;角和威默,2003年;Schetelig et al ., 2009;Marinotti et al ., 2013;谭et al ., 2013;柯蒂斯et al ., 2015;燕和斯科特,2015;Schetelig et al ., 2016;外耳et al ., 2020),有吸引力的使用大剂量的抗生素等维护股票数量抵消潜在的致命性泄漏。在这里,我们表明,在高剂量的抗生素Tet-off构造的表达减少到最小的在细胞培养实验中,这种治疗方法可能产生深远影响的表现d . suzukii转基因菌株采用Tet-off系统。我们核实,给阿霉素但不是春节F0苍蝇镇压了F1女杀伤力V229_M4f1颗压力。我们还发现父母对待阿霉素生产转基因雄性后代明显低于其他抗生素治疗。一个全基因组的研究表明,在几个春节衍生品、阿霉素引起基因表达的最重要的反应酿酒酵母(桑切斯et al ., 2020),它还大大改变细胞代谢和损害线粒体功能(鲁格尔手枪et al ., 2018)。因此,尽管阿霉素比春节更有效的抑制分子,它可能破坏了致命的系统在指定的阶段和有一个更严重的对应变的影响健康。

Tet-off构造为在体外分析包含相同的驱动盒(Dsnullo-tTA)和TRE-hs43 V229构造用于生成FK株V229_M4f1和V229_M8f2队。唯一的区别是效应的部分。而2肽记者磁带作为视觉标记的在体外实验中,pro-apoptotic效应基因Dshid^Ala4V229允许我们评估得分的转基因表达女性的致命的表型。集体,我们表明,(更多)女性幸存者可以增加我们颗菌株在某些抗生素治疗。的应变V229_M4f1显示适度的转基因活动,给阿霉素,F0雄性或雌性抑制雌性F1的杀伤力,和喂养春节或阿霉素F0雌性F1(但不是男性)生成的长寿女性。的应变V229_M8f2显示转基因活动疲弱,喂养春节F0女性推迟女性杀伤力F2。压制F1的杀伤力观察在我们颗菌株可能是因为抗生素,继承了这一代的影响,正如前面提出的几项研究(角和威默,2003年;Schetelig et al ., 2009;Ogaugwu et al ., 2013;燕和斯科特,2015;阿帕德海耶et al ., 2022)。的抑制杀伤力的另一个可能的原因是与父母的性是父母的影响,如父母的印记。亲代印迹指的现象,基于不同等位基因的表达父母的性别传播等位基因(劳埃德,2000;Lemos et al ., 2014)。在d .腹,印记通常与异染色质或地区与特定的染色质结构和经常导致表观遗传沉默(雅培et al ., 2013;Lemos et al ., 2014;麦凯克伦et al ., 2014)。可能是测试的转基因V229菌株是插入到基因组区域的imprinting-prone染色质结构;因此,父本转基因的一个活跃的形式传播,而女性传播一种不活跃的沉默导致F1幸存者(表1)。此外,继代印记也观察到d .腹(哦,et al ., 2020),这可能与一代延迟相关应变V229_M8f2杀伤力(图4)。可以进行进一步的研究调查的影响父母印记transgene-based致命的系统,如验证基因的转基因和染色质结构,比较表观遗传沉默的转基因从父母的男性和女性,和继代影响印迹在转基因的活动。

潜在的抗性Tet-off-based致命的系统可能取决于杀伤力的机理以及转基因活动从每个特定的菌株。对于实际应用,菌株具有较强的工程杀伤力(否则)可能优于弱的或完整的外显率很高的杀伤力mass-rearing场景。强烈的或多余的杀伤力可以帮助抵消在野生种群的耐药性(克努森et al ., 2020)。然而,它也可能加快第二项的生成电阻突变导致的基因崩溃RIDL杀伤力d .腹(赵et al ., 2020)。因此,将两个或两个以上的致命的效应器/系统纳入昆虫菌株用于使用可以帮助确保完整的外显率的杀伤力和减少阻力的发展(Jaffri et al ., 2020;燕和斯科特,2020;李et al ., 2021;阿帕德海耶et al ., 2022)。对于任何遗传控制策略采用Tet-off系统,过度使用春节或其衍生品可以减少压力的健身或导致幸存者,这可能会导致意外伤害或减少控制效率。因此,抗生素的整体效应,包括父母和继代影响,工程杀伤力和昆虫健身需要仔细评估一个物种——和毒株特异性的方式安全、高效实用的应用程序。一起坐下来等基因控制程序不兼容的昆虫技术(Nikolouli et al ., 2018;Sassu et al ., 2020),转基因致命的毒株可能促进全球害虫的可持续管理d . suzukii。

数据可用性声明

最初的贡献提出了研究中都包含在这篇文章/补充材料;进一步询问可以针对相应的作者。

作者的贡献

YY,黑洞,SP和TR进行了研究。YY构思研究和分析数据。YY, MFS协调项目和写的手稿。所有作者阅读和批准最终的手稿。

资金

这项工作由德意志Forschungsgemeinschaft (DFG),项目编号470105316和格兰特丫502/3-1 YY。

确认

作者感谢茱莉亚Hehner,凯文•鲍曼Tamara Zenz,森林Lobsack,娜塔莉Schlimm,怪不得我艾伯特,克里斯蒂娜Borghesi帮助飞库存和杀伤力测试。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

处理编辑F.M.宣布与作者M.F.S.过去合作

出版商的注意

本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或那些出版商编辑和评论员。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。

补充材料

本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fbioe.2023.876492/full补充材料

补充表S1|抗生素对活细胞的影响。

补充图S2| ELISA分析来衡量抗生素d . suzukii成年人和鸡蛋。

引用