Biocontainment策略在活的有机体内的应用酿酒boulardii
卡尔·亚历克斯赫定
Vibeke克鲁斯
鲁本Vazquez-Uribe *
Morten奥托·亚历山大·萨默- 诺和诺德基金会Biosustainability中心,丹麦技术大学,公斤,丹麦
人类胃肠道是一个复杂和动态的环境,在其中扮演着重要的角色在人类健康。微生物工程表达治疗性活动已成为一种新颖的方式来管理多种疾病。这种先进的微生物疗法(郡)必须包含在个别对待。因此安全、健壮biocontainment策略需要防止微生物的增殖外单独对待。这里我们提出第一个biocontainment战略益生菌酵母,示威的多层策略结合营养缺陷型的和环境敏感的策略。我们摧毁了基因THI6和BTS1,分别导致硫胺素营养缺陷型和增加对寒冷敏感。的biocontained酿酒boulardii上面显示没有限制增长硫胺素1 ng / ml,表现出严重的增长缺陷在温度低于20°C。biocontained株在小鼠和良好的耐受性和可行论证平等祖先non-biocontained应变肽的生产效率。在组合中,数据支持thi6∆和bts1∆使biocontainments . boulardii这可能是一个相关的底盘为未来基于酵母数量。
介绍
人类微生物组的治疗潜力受到很大关注,作为microbiome-host互动发挥着至关重要的作用在各种疾病(Eckburg Relman, 2007;西尔斯和加勒特,2014年;Itzhaki et al ., 2016;Canfora et al ., 2019)。因此,利用微生物工程生活治疗疾病是一个新兴的方法合成生物学领域的。高级微生物疗法(郡)组成微生物已被转基因表达治疗性活动而出现在人类微生物群。先前的工作已经证明了使用数量提供治疗性生物分子(Steidler et al ., 2000;陈et al ., 2014;Arora et al ., 2016)或降解有毒化合物(伊莎贝拉et al ., 2018;库尔茨et al ., 2019在胃肠道)。益生菌酵母酿酒boulardii最近关注AMT底盘,因为它允许生物合成,折叠和翻译修饰的几个治疗相关的肽和蛋白质(尼尔森,2019)。美国boulardii是一个安全的微生物有超过40年的使用作为一个人类益生菌(Kelesidis Pothoulakis, 2012)。然而,一个重要的考虑在郡的设计biocontainment策略限制转基因微生物增殖的风险外,个别对待。因此,策略biocontainment必须开发美国boulardii以确保其作为AMT将来使用。
有效的biocontainment策略应考虑的因素包括mutagenetic漂移、环境补充和水平基因转移(Moe-Behrens et al ., 2013)。已经探讨了一些biocontainment策略防止工程微生物的增殖和生存不良环境(钟旭李et al ., 2018)。这些策略包括营养缺陷型(Steidler et al ., 2003;Bahey-El-Din et al ., 2010;伊莎贝拉et al ., 2018),合成营养缺陷型(Marliere et al ., 2011;ibsen Pinheiro et al ., 2012;•罗夫纳et al ., 2015),multispecies财团(梅伊et al ., 2014;约翰·et al ., 2016),合成基因电路(陈et al ., 2016;黄et al ., 2016;混杀丹et al ., 2016;斯特灵et al ., 2017),CRISPR-based杀死开关(Caliando沃伊特,2015;Rottinghaus et al ., 2022),或它们的组合(加拉格尔et al ., 2015);然而,每种方法有风险。营养缺陷型的可以通过清除基本代谢物从附近的衰退细胞或槽建立生态利基市场。合成营养缺陷型可能克服这些障碍;然而,它需要补充的胃肠道有额外的生存因素。实现合成基因电路和CRISPR-based biocontainment策略会导致减少健身biocontained应变(Moe-Behrens et al ., 2013),导致选择性压力逃避突变体(乌里韦et al ., 2021)。因此,为了防止扩散在不同的环境中,必须实现多种策略建立一个健壮的biocontainment系统。
虽然biocontainment细菌数量迅速先进的方法(Steidler et al ., 2003;Bahey-El-Din et al ., 2010;伊莎贝拉et al ., 2018;Rottinghaus et al ., 2022),策略真核数量仍下落不明。在这项研究中,我们试图开发一个biocontainment策略美国boulardii。自美国boulardii是真核生物,水平基因转移的风险很低(Emamalipour et al ., 2020),美国boulardii无法交配由于其孢子形成缺陷(麦克法兰,1996;Offei et al ., 2019)。在一起,这些因素降低引入的风险基因电路或改造的DNA进入自然生态系统。不过,工程的风险美国boulardii增殖外环境中处理主机必须加以解决。为了解决这个问题,我们试图实现biocontainment策略美国boulardii通过减少健康的益生菌酵母以外的人类宿主(图1)。我们决定评估biocontainment对冷敏感和营养缺陷型的能力美国boulardii菌株。
图1。图形的抽象实现biocontainment策略。(一)原理概述biocontainment的选择压力。(B)酵母细胞破坏的基因合成尿嘧啶(URA3)、硫胺素(THI6),geranylgeranyl二磷酸合酶(BTS1)可以在内部环境中生长包含必要的营养和最佳温度。然而,扩散在外部环境中缺乏必要的营养和低气温将是有限的。
材料和方法
质粒和菌株建设
这个研究的引物,质粒,gBlocks和gRNA序列中列出补充表S1−S4。DNA寡核苷酸和gBlocks被命令集成技术(IDT)。生成URA3S81X全局的−),HIS3G26X(SbH−),TRP1P12X(SbT−)中断菌株,gBlocks gRNA分别与pCfB2312组装(Cas9-KanMX)和转换与各自的捐助底漆(补充表S1)。生成thi2∆,thi6∆,snz1∆,sno1∆,rei1∆,bts1∆菌株,分别gBlocks从gRNA与pCfB3050组装(pCas9 -URA3)和转换与分别捐助底漆(补充表S1)。GFP, RFP和Exendin-4整合质粒(补充表S2)生成装配的各自gBlocks(补充表S3)与pCfB2909 pCfB6920一起(免费的)标志和转换。
所有的质粒与吉布森组件进行组装(吉布森et al ., 2009),变成了一次机会®全球大肠杆菌(热费希尔科学)。所有大肠杆菌是生长在溶原性肉汤(磅)媒体包含5 g / L酵母提取物,10 g / L胰蛋白胨和10 g / L氯化钠;(西格玛奥德里奇)补充100 mg / L氨苄青霉素钠盐(西格玛奥德里奇)。磅琼脂板含有1%琼脂(西格玛奥德里奇)。
美国boulardii(酿酒酵母写明ATCC®MYA796™)获得美国类型文化集合(写明ATCC)。在这项研究中列出创建的菌株补充表S5。美国boulardii进行了转换通过酵母高效转换使用LiAc / SS载体DNA /挂钩方法(Gietz和森林,2006)。基因组集成磁带与限制性内切酶消化NotI (FastDgiest酶,热科学™)之前转换和转换以及各种辅助质粒和pre-expressed Cas9 pCfB2312。所有转换都孵化30°C 30分钟,然后同时在42°C水浴60分钟。所有转换之前恢复步骤。转换管是微型离心机在3000 g 2分钟。球在500年resuspendedµL YPD媒体包含10 g / L酵母提取物,20 g / L酪蛋白胨和20 g / L葡萄糖(西格玛奥德里奇)和孵化2 - 3 h被镀前30°C。酵母的转换都是镀在合成完整(SC)板块包含1.7 g / L酵母氮基没有氨基酸和硫酸铵(西格玛奥德里奇),1 g / L谷氨酸钠(西格玛奥德里奇),1.92 g / L酵母合成退出媒介补充剂没有尿嘧啶(西格玛奥德里奇)和200 mg / L geneticin (G418;西格玛奥德里奇)37°C。使用OneTaq Colony-PCR(热科学™)证实了基因整合,破坏和基因敲除的基因。引物的侧面零变异基因或集成网站被用来确认修改成功的压力。沸腾的细胞基因组DNA提取的70°C的30分钟20毫米氢氧化钠。 The strains were cured for pCfB2312 and helper plasmids after genome integration. One single mutant from each generated strain was cryopreserved at −80°C and used for further characterisations. All strain replicates presented are technical replicates.
培养实验
所有从pre-culture开始培养,接种最近有殖民地从80°C cryostock−,培养12 - 16 h。pre-cultures都在相同的媒体进行栽培实验后,除非其他说明。Pre-culture确定营养缺陷型的菌株在媒体补充所需的营养和PBS洗了三次1%确保没有所需的营养的痕迹都被转移到新的文化。Pre-culture确定冷敏感性是由37°C,以确保足够的生物量。
实时增长监控
实时OD600年测量了每10分钟48 - 120 h和标协同™H1 (BioTek)有氧和microaerobic条件。时代2标(BioTek)是用于厌氧实时OD600年测量。所有文化有一个初始OD600年0.05。文化是孵化成200µL最小合成完整的媒体(代尔夫特)包含7.5 g / L (NH4)2所以4,14.4 g / L KH2阿宝4,0.5 g / L MgSO4x 7 h2啊,20 g / L葡萄糖,2毫升/ L微量金属解决方案,1毫升/ L维生素有或没有硫胺和吡哆醇(Verduyn et al ., 199220 mg / L),有或没有尿嘧啶,20 mg / L组氨酸和20 mg / L色氨酸补充。本®96细胞培养板(他一一Bio-One)与一个air-penetrable盖子(松一口气,多样化的生物技术)是用于所有种植。pH值调整了1 m盐酸3、4、5和6的各自的实验。培养进行连续的双重轨道振动548次每分钟(CPM) 37°C和0%,0.1%,1%或21%的氧气。厌氧条件下获得使用厌氧乙烯室(腼腆的实验室产品乙烯;气体混合物,95% N2和5% H2使用有限公司),microaerobic条件得到2/ O2气体控制器(BioTek)。
硫胺素剂量反应实验
文化是孵化成200µL SC媒体没有硫胺素,包含1.7 g / L酵母氮基没有氨基酸、硫胺素(中小™),1.92 g / L酵母合成退出媒介补充剂没有尿嘧啶,48 h,最初OD600年0.05。媒体也补充了0,0.001,0.01,0.1,1,或者400μg /毫升盐酸硫胺素(西格玛奥德里奇)和20 mg / L尿嘧啶。
逃跑率实验的硫胺素营养缺陷型
的业务单位−和业务单位−+thi6∆菌株在25毫升孵化SC有无硫胺素补充了h。120年文化孵化与初始OD摇瓶250毫升600年0.05。500年的文化是旋转下来re-suspendedµL PBS。生成一个串行稀释。100µL稀释和5从每个稀释µL镀在SC板有无硫胺素补充(补充数据S3B, C)。盘子被孵化72 h的37°C。细胞群的稀释5µL发现就摊在SC板块有或没有硫胺素补充(补充数据S3B, C)。
寒冷暴露实验
的业务单位−死伤,−+rei1∆,业务单位−+bts1∆和业务单位−+bts1∆+thi6∆菌株被孵化在2.6毫升YPD 24-deep板(Axygen®VWR)与一个三明治封面(Enzyscreen)和初始OD600年0.05。板块在孵化15、20和37°C的最大120 h。OD600年测量在0 8,24岁,32岁,48岁,72年、96年和120年h。
竞争的存在和缺乏硫胺的实验
单和co-cultivation全局−gfp和全局的−+bts1∆+thi6∆)-mKate培养2毫升SC媒体有无硫胺素24-deep板(Axygen®VWR)与一个三明治封面(Enzyscreen)和初始OD600年0.1。1:1比例的培养开始每个应变。20µL单一和培养转移到新媒体每48小时总共96 h(两个转移)。
竞争实验在不同的温度
单和co-cultivation全局−gfp和全局的−+bts1∆+thi6∆)-mKate培养2毫升SC媒体YPD 24-deep板(Axygen®VWR)与一个三明治封面(Enzyscreen)和初始OD600年0.1在15°C, 20°C,和37°C。1:1比例的培养开始每个应变。20µL单一和培养转移到新媒体每24小时总段120 h(五)20°C和37°C栽培。单和培养15°C被转移到新媒体每48小时总段144 h(三个转移)。文化是每48小时,以确保业务单位转让−达到类似的细胞数量在所有温度下(补充图S6)。
生存分析
连续稀释(1000 x 10000 x) 37°C co-cultivation全局−gfp和全局的−+bts1∆+thi6∆)-mKate YPD镀在YPD盘子和孵化15°C, 144年20°C和37°C,分别为96年和48 h。红色和绿色集落形成单位(CFU)被计算在蓝光。
流式细胞术
所有竞争实验分析与NovoCyte Quanteon™(安捷伦)流式细胞术。20µL文化180年稀释µL 1% PBS和运行在一个阈值的流式细胞术5000酵母事件或60µL样本注入。酵母事件是封闭的基于大小事件(FSC-A) < 6×106和复杂事件(SSC-A) < 2×105。背心是门基于SSC (SSC-A比SSC-H)。(单位)gfp人口与FITC量化频道,和全局的−+bts1∆+thi6∆)-mKate与PE-TexasRed量化。人口分布是根据FITC-H vs PE-TexasRed-H量化。计算绝对事件。
Elisa
Exendin-4生产美国boulardii菌株在孵化2毫升代尔夫特中补充了20 mg / L 24-deep好板(Axygen尿嘧啶®,VWR)和一个三明治(Enzyscreen)。文化有一个初始OD600年0.05,进行连续摇晃在250 RPM 37°C。所有文化都收获24和48 h。细胞培养后纺在10000 g 10分钟4°C。Exendin-4量化了Exendin-4环评(ek - 070 - 94、凤凰城)。OD探测到的信号450年使用一个微型板块读者协同™H1 (BioTek)。
动物实验
所有动物实验进行实验动物福利,根据丹麦指南和丹麦动物实验研究协议被批准的检查员(许可证编号2020-15-0201-00405)。进行这项研究是按照到达指南(du泽特et al ., 2020)。所有在活的有机体内雄性C57BL / 6小鼠实验(6−8周大;塔康生物科学)。除非另有说明,所有老鼠都安置在室温下在12 h光/暗周期和随意水和标准食物(安全饮食,故事本来)。所有小鼠随机根据体重和驯化至少1周之前第一个口服。每只动物研究收到一批刚做好的美国boulardii。体重和食物摄入量每周记录一次。研究人员在老鼠实验蒙蔽了。老鼠的安乐死,颈椎错位的研究。
小鼠被分为四组(n = 4),要么收到某人的野生型,某人bts1∆,某人thi6∆或某人bts1∆+thi6∆压力。老鼠口服通过胃内的强饲法与∼108CFU的美国boulardii菌株100年µL 1 x PBS和20%的甘油。老鼠口服接种美国boulardii连续五天,日惨败。饮用水与抗生素鸡尾酒补充含0.3 g / L的氨苄青霉素钠盐,0.3 g / L硫酸卡那霉素,0.3 g / L灭滴灵,和0.15 g / L盐酸万古霉素后冲刷时期。5天的抗生素治疗后,小鼠口服接种美国boulardii100年µL 1 x PBS(包含1.0 g / L氨苄青霉素钠盐,1.0 g / L硫酸卡那霉素,1.0 g / L灭滴灵,和1.0 g / L盐酸万古霉素)和10%甘油连续五天。的冲刷antibiotic-treated老鼠被监控了33天。
的粪便收集预先称量好的1.5毫升或2.0毫升埃普多夫管包含1毫升1 x PBS和25%的甘油,重又确定粪便重量。所有样品制备评估CFU数字保存在冰和遵循了同样的做法。粪便样本单一化的漩涡在∼2400 rpm样本20分钟。然后旋转100 g 30年代,紧随其后的是一个稀释系列,每个稀释5µL镀在副本或一式三份。下antibiotic-treated冲刷时期,100年µL镀。粪便样本镀在SC补充20 mg / L尿嘧啶板块含有100 mg / L氨苄青霉素,50 mg / L卡那霉素和30毫克/ L氯霉素(西格玛奥德里奇)。
统计测试
所有统计分析进行RStudio版本4.1.0 rstatix和DescTools包。除非另有说明,所有的数据都意味着+ SEM。统计两组之间的差异和独立样本t检验分析。Bonferroni调整用于多重比较。比较分析了三个或更多组的方差分析与图基HSD事后测试或Dunnett的事后测试。是统计显著性水平p< 0.05。
结果
选择最佳的营养缺陷型的美国boulardiibiocontainment
我们开始通过调查的影响制约益生菌酵母成为依赖于外源性代谢物对生长和存活的供应,因为它是最常见的一种biocontainment转基因微生物(策略钟旭李et al ., 2018)。在这里我们生成一个营养缺陷型的图书馆美国boulardii菌株通过扰乱多个基因和评估每个菌株的基因缺失的负担。我们创建了一个核苷(尿嘧啶),两种氨基酸(组氨酸和色氨酸)和两种维生素(硫胺素和吡哆醇)营养缺陷型的菌株(图2一个)。我们开始通过引入一个终止密码子URA3(尿嘧啶合成),HIS3(组氨酸合成)和TRP1(色氨酸合成),选择biocontainment的基础,也可以作为营养缺陷型的标志工程进一步压力。营养缺陷型的标记中常用微生物工程建立一个不使用平台plasmid-based外源基因表达式(Durmusoglu et al ., 2021)。这些营养缺陷型的菌株曾被报道美国boulardii(刘et al ., 2016)。重要的是,这些基因中断菌株适合进一步遗传操作使用现有的主机酿酒酵母工具(哈德逊et al ., 2014;刘et al ., 2016;Durmusoglu et al ., 2021;金et al ., 2021)。的菌株URA3,HIS3,和TRP1中断无法生长,除非尿嘧啶、组氨酸或色氨酸是补充生长培养基(图2 b, C)。的TRP1P12X(SbT−)应变也显示与色氨酸代谢负担当媒体补充(图2 c;补充图S1)。基于这些观察,HIS3G26X(SbH−),URA3S81X全局的−)营养营养缺陷型菌株显示是最有前途的SbT相比−压力。的组合URA3,HIS3,TRP1保持他们的营养缺陷型的表型和基因中断显示限制媒体缺乏各自的营养(增长图2;补充图S2)。然而,三重破坏应变显示不稳定,增长120 h后观察到缺乏色氨酸。的业务单位−应变被选为进一步的基因淘汰赛中基于以前的报告显示更高的基因表达URA3标记的质粒(Durmusoglu et al ., 2021)。
图2。选择的营养缺陷型的突变美国boulardii。(一)营养缺陷型的菌株建设的概述图。生成尿嘧啶、组氨酸和色氨酸营养缺陷型,介绍了零突变在各自的基因,而这些基因被删除生成维生素营养缺陷型。酒吧的情节意味着OD600年48 h后(B)没有所需的营养补充和(C)与所需的营养补充。(D)酒吧的情节意味着OD600年48 h后在不同浓度的硫胺素。检测极限(LOD)。数据作为意味着+ SEM (n = 3)。*p< 0.05,* *p< 0.01和* * *p< 0.001。单向方差分析,Dunnett事后测试与某人(一)或业务单位−(B, C)作为参考。
我们进一步研究了干扰两个生物合成途径的表型菌株与尿嘧啶合成不足来确定潜在的添加剂的影响。敲出的THI2或者是THI6硫胺素合成通路中的基因导致菌株不能生长在媒体缺乏硫胺(图2 b)。敲出SN啊1和SNZ1单独吡哆醇合成途径的基因缺陷导致没有显著增长,与之前报道(Rodriguez-Navarro et al ., 2002)。最终OD Non-etheless,显著降低600年观察敲出什么时候SNO1和SNZ1基因的组合。证明生长缺陷导致各自的营养缺陷型,我们培养各种菌株在媒体包含相应的营养补充剂和观察到类似的OD600年到达后48 h (图2 c)。
检查营养缺陷型的菌株对环境的鲁棒性经验丰富的人类胃肠道中,我们评估了他们的生长性能与pH值最小的媒体和氧气条件更紧密地模仿胃肠道。的thi2∆应变相比,显示这是一个更合理的代谢负担thi6∆在pH值增加-50%,显示25%倍增时间3、6,microaerobic氧(0.1%和1%),与厌氧条件thi6∆应变(补充图S1)。的thi6∆应变略有增长的缺陷在pH值4和5,证明倍增时间高于3% - -6%thi2∆(补充图S1)。
我们接下来评估硫胺素敏感性菌株识别所需的最低硫胺素浓度增长的thi2∆和thi6绕过biocontainment∆菌株。淘汰赛中达成了一项降低最终OD600年在一个浓度≤0.01μg /毫升(图2 d)。的thi6∆应变出现对低硫胺浓度比更加敏感thi2∆压力。我们也证实了从120 - h与没有硫胺素文化出现在媒体中,零排放器被确定的thi6∆应变(补充图S3)。
构建对冷敏感的美国boulardii菌株
另一个策略来减少转基因微生物在特定环境下的扩散使其对温度变化敏感,可能发生在目标环境(图3一)。评估这种方法,我们摧毁了两个基因(REI1和BTS1)以前报道表现出增长的缺陷在温度低于25°C时摧毁了酿酒酵母(江et al ., 1995;挂和约翰逊,2006年;Lebreton et al ., 2006)。REI1基因编码一个锌指蛋白60年代复杂的一部分,和BTS1基因编码酵母geranylgeranyl二磷酸合酶。我们观察到预期的生长缺陷的温度在15°C和20°Crei1∆和bts1∆菌株(图3 b)。虽然两bts1∆和rei1∆菌株在15°C和高度敏感显示有限增长120 h后,rei1∆显示缺陷更加明显增长;然而,rei1∆应变也显示经济增长放缓在37°C (补充图S4)。
图3。构建热敏美国boulardii菌株。(一)实验设计的图形演示确认表型。(B)酒吧的均值曲线下面积(AUC) 96 - h培养15°C, 20°C和37°C。(C)酒吧情节意味着倍增时间的pH值3、4、5和6。检测极限(LOD)。数据作为意味着+ SEM (n = 3)。双向方差分析,图基事后测试。不同的字母(a, b, c, d, e, f, g, h)酒吧上方显示统计不同群体(显著性水平p< 0.05)。
此外,评估两个对冷敏感的菌株gut-like条件下,我们证明rei1∆应变表现出更明显的健身成本最小的媒体在不同的pH值(图3 c)。的rei1∆菌株不能生长在pH值低于4 72 h后,和应变表现出一种近似慢25%倍增时间pH值4,5、6相比全局的父母的压力−)。的rei1∆应变也显示出显著降低增长率在厌氧和microaerobic条件比业务单位−(补充图S5),而bts1在厌氧条件下∆显示较慢的增长速度。倍增时间在厌氧条件相对更明显了bts1∆比rei1∆压力。
维生素营养缺陷型结合对冷敏感的突变作为一个健壮的biocontainment策略
生成一个更健壮的biocontainment应变,我们结合营养营养缺陷型和对冷敏感的突变(图4一)。具体来说,我们选择thi6∆和bts1∆,业务单位−背景,基于功能在不同pH值和氧浓度梯度。虽然rei1∆应变显示更明显生长阻滞在较低温度下我们假设更多的健身成本通过基因缺失或外源基因表达式将限制在胃肠道中生存的压力。双基因敲除的BTS1和THI6保持个人淘汰赛的表型效应,证明不能生长在没有补充硫胺素和增长放缓的温度低于20°C (补充图S4, S6)。
图4。结合对冷敏感的描述和营养缺陷型的压力。(一)堆叠柱形图的全局的百分比−和业务单位−+bts1∆+thi6∆共培养实验中,没有硫胺素。培养被转移到一个新的文化每48 h (n = 5)。(B)堆叠柱形图%的业务单位−和业务单位−+bts1∆+thi6∆在共培养实验15°C, 20°C, 37°C。的培养被转移到一个新的文化每24或48小时(n = 5)。(C)酒吧的情节意味着Exendin-4浓度(ng / ml)量化在24和48 h的上层清液培养(n = 3)。数据意味着+ SEM。*p< 0.05、单因子变异数分析,Dunnett的事后测试业务单位−作为参考。
接下来,我们评估的竞争健身双重淘汰赛biocontainment应变与家长控制株培养单位−在缺乏硫胺和在不同的温度下。双基因敲除和控制应变执行同样的硫胺素;然而,在缺乏硫胺,双基因敲除菌株后未被发现的两个传输(图4一;补充图S6)。以同样的方式,双基因敲除菌株和控制应变同时能够生长在允许的温度37°C条件;然而,在15°C和20°C,可大大降低双基因敲除菌株的比例逐步与文化转移的数量(图4 b)。biocontainment双基因敲除菌株保持∼酵母总数的1%人口的两个转移后共培养后15°C和5%∼五转移20°C。
此外,我们测试了biocontainment应变是否会维持其对冷敏感的表型在几代人培养和控制应变37°C (120 h)。在这里,我们观察到双基因敲除菌株保持其对冷敏感的表型,说明零镀后殖民地文化,孵化的应变15°C和保持经济增长放缓表型在20°C (补充图S8)。双基因敲除biocontainment应变也没有显示出协同增长缺陷在不同pH值和氧浓度百分比(补充图S9)。我们也观察到联合biocontainment应变硫胺素敏感性增加,显示出显著降低OD600年在48 h后1μg /毫升(补充图S10)。
最后,我们试图调查如果双淘汰赛biocontainment应变能产生类似水平的重组蛋白作为全局的父母的压力−。这是相关的,因为有些基因淘汰赛中可能产生负面影响蛋白质合成(Puddu et al ., 2019)。因此,我们策划biocontainment菌株生产和分泌GLP-1受体激动剂(Exendin-4)原位生物合成的Exendin-4胃肠道美国boulardii曾被证明能减少食物摄入量和体重小鼠(赫定et al ., 2022 a)。我们观察到无显著差异生产Exendin-4 24和48 h后(图4 c),这表明biocontainment应变不妥协的生产不同的蛋白质。
biocontainment株在小鼠模型是安全、可行的
虽然我们验证biocontainment策略功能在体外,生成的基因敲除菌株仍需证明在胃肠道是安全、可行的表达治疗活动。评估这个,我们口头管理biocontainment菌株连续5天每天在传统老鼠与一个完整的微生物(图5一个)研究如果biocontainment菌株构成任何健身成本而与其他微生物相互作用。我们证明了野生型、单一和组合淘汰赛殖民同样在小鼠完整微生物(图5 b)。此外,所有的美国boulardii菌株洗了6天之后,除了一个鼠标接收bts1∆应变(图5 c),这表明淘汰赛中没有造成任何不必要的小鼠的移植。
图5。在活的有机体内评估antibiotic-treated biocontainment菌株的老鼠。(一)图形研究的方案设计。雄性C57BL / 6小鼠口服接种∼108细胞的美国boulardii每天连续五天,其次是6天的惨败。第十天,水补充与抗生素鸡尾酒。老鼠又口头管理与∼108细胞的美国boulardii每天连续五天,紧随其后的是34天的惨败。(B)酒吧的情节美国boulardii丰富(日志10每克粪便CFU)在传统老鼠与完整的微生物。(C)一步的比例的普通老鼠美国boulardii殖民(LOD≈103CFU / g)。(D)酒吧的情节美国boulardii丰富(日志10antibiotic-treated小鼠CFU每克粪便)。(E)一步情节antibiotic-treated小鼠的百分比美国boulardii殖民(LOD≈50 CFU / g)。(F)体重(克)在整个研究。(G)积累了食物的摄入量(克)在整个研究。数据作为意味着±SEM (n = 4)。数据与单向方差分析进行分析(B, D)和双向方差分析(F, G),使用Dunnett的事后测试业务单位−作为参考。
此外,我们评估了biocontainment菌株在antibiotic-treated小鼠模型用于临床前测试基于酵母数量,它允许美国boulardii株移植小鼠胃肠道的更高的数字和一段时间(赫定et al ., 2022 b)。biocontainment的antibiotic-treated小鼠口服接种菌株5天。野生型、单并结合淘汰赛中也被证明殖民同样在小鼠减少微生物群(图5 d)。虽然美国boulardiiantibiotic-treated冲刷慢的老鼠,老鼠没有显示任何可检测水平持续口服后33天(图5 e)。
调查如果带来任何安全问题新生成的菌株的健康和福祉的老鼠,体重、食物摄取和行为监控在整个研究。我们观察到体重没有变化或进食老鼠接收biocontainment菌株(图5 f, G),在低和高的菌株的殖民化。此外,没有观察到小鼠异常行为。
讨论
Biocontainment数量的发展,是一个关键的一步,因为它限制了转基因微生物的增殖在个别对待。因此,限制而自然生物的风险和负面影响生态系统和人类健康(威尔逊,2008)。在这项研究中,我们实现了一个biocontainment战略益生菌酵母s . boulardii证明小鼠胃肠道的强劲增长和有限的增长在体外条件模拟外部环境(图1)。
我们设计了一个多层次的策略通过引入营养缺陷型和温度敏感性。我们选择的业务单位−作为背景菌株进行进一步的遗传操作,因为它被证明预期作为营养缺陷型和表型性状URA3标记已报告质粒基因表达高于HIS3和TRP1标记的质粒美国boulardii(Durmusoglu et al ., 2021),是一种常用的标记(詹森et al ., 2014;Maury et al ., 2016)。接下来,我们评估额外的营养缺陷型的淘汰赛中作为潜在的影响策略。而thi2∆和thi6功能试验(∆菌株显示受限制的增长图2 b),均显示在OD略有增加600年在0μg /毫升硫胺素硫胺素剂量实验(图2 d)。这可以解释为一个小型微量pre-culture硫胺素可以转让的;另外,媒体缺乏维生素b6株更敏感。Non-etheless,硫胺素营养缺陷型的菌株,thi6∆,表现出更为明显和敏感效应硫胺素含量低于thi2∆。此外,THI2硫胺素生物合成的基因的转录激活因子(Nishimura et al ., 1992),而THI6硫胺素合成所需的是一个基因编码一种酶(Nosakas et al ., 1994);因此,绕过幸免型的转录激活可能会造成更高的风险比获得一个酶的功能。虽然thi2∆应变表现出慢倍增时间在五个测试条件显示较快增长pH值4和5 (补充图S1)。这可以解释为,美国boulardii与尿嘧啶中断一般pH值增长速度在4和5,因此生长缺陷thi2∆可能升级之外的最佳pH值条件。
进一步含有益生菌酵母,我们研究了热敏基因敲除菌株的潜力。全球平均温度计算是13.9°C (Sobrino et al ., 2020),尽管温度在不同的地方,不同的时代,我们假设,减少健身的AMT温度范围将限制在许多地方扩散。我们比较两个基因淘汰赛中导致应变敏感冷温度(江et al ., 1995;挂和约翰逊,2006年)。敲出BTS1和REI1减少了健身的菌株在温度≤20°C (图3)。我们优先考虑bts1尽管∆压力rei1∆应变表现出更明显的增长缺陷在20°C。这是基于事实的rei1∆应变也显示经济增长放缓在37°C和增加健身成本在不同pH值和氧气条件下胃肠道(图3;补充图S5)。此外,据报道,过度的REH1和删除ARX1能部分抑制rei1∆对冷敏感的生长表型(Lebreton et al ., 2006;帕内尔和低音,2009年)。因此,rei1∆应变可能增加的风险选择压力的逃避突变体。
建立更多的冗余策略结合营养缺陷型的突变体thi6∆和对冷敏感的突变bts1在后台∆应变单位−进一步减少外部的健身环境和逃避突变的几率降到最低。最后biocontainment应变表现出相似的表型性状作为个人淘汰赛。我们还证明了家长控制张力大大比双biocontainment除非硫胺素是补充和培育在37°C (图4)。此外,硫胺素缺席媒体时,双biocontainment应变也同样限制在mono-culture培养控制菌株,表明菌株之间的任何潜在的硫胺素槽并不足以维持biocontainment应变的增长。
基因敲除菌株表现出对多肽合成可忽略不计的影响,表明biocontainment应变仍然可以充当AMT提供治疗性多肽(图4 c)。此外,我们观察到类似的表型生长性能在不同的pH值和氧气条件下,展示强劲的潜在环境变化的应变。
我们最后确定的可行性和安全性健康小鼠的单引号和双基因敲除菌株(图5)。没有观察到小鼠的差异不同群体之间的健康和福祉,证明基因敲除菌株没有构成威胁健康的小鼠。粪便中的biocontainment菌株的生存能力是证明达到同等水平与野生型相比,在天真和antibiotic-treated老鼠。每克粪便和冲刷的丰度美国boulardii在小鼠胃肠道与之前报道的数据(赫定et al ., 2022 b)。这支持了假设biocontainment应变不受任何明显的胃肠道的健康成本一只老鼠。此外,它表明,硫胺的浓度在小鼠肠道就足够了thi6∆应变增长。
郡搬到人类需要确保AMT底盘的安全策略。我们的研究演示了一个多层biocontainment验证在实验室生长条件和策略在活的有机体内胃肠道的老鼠。虽然可能需要进一步的组合策略,以确保完整的控制酵母,我们在这里展示,作者的知识,第一个biocontainment策略作为基于酵母的持续发展平台数量。
数据可用性声明
原始数据支持了本文的结论将由作者提供,没有过度的预订。
道德声明
动物研究回顾和批准丹麦动物实验检查员(许可证编号2020-15-0201-00405)。
作者的贡献
KH和RV-U构思。KH和RV-U设计在体外实验,KH、RV-U VK设计在活的有机体内实验。KH执行所有在体外特征,KH和VK的进行在活的有机体内特征。KH。分析了数据,并写了手稿。RV-U和监督女士。所有作者贡献的讨论结果。所有作者阅读和批准最终的手稿。
资金
这项工作获得由诺和诺德基金会的资助下NNF格兰特号码:NNF20CC0035580, NNF挑战计划CAMiT赠款协议:NNF17CO0028232和BestTreat项目在欧盟的地平线2020研究和创新计划与玛丽Skłodowska-Curie赠款协议没有813781。
确认
我们感谢安娜Gutio玛利亚我Vilardell协助构建淘汰赛,Nicoline芒克米凯尔森开展一些增长特征和卡门金沙协助建立流式细胞仪实验,并提供全局的−)“绿色荧光蛋白”。我们也感谢蒂芙尼商亨Mak,卡门沙滩和他Holger Vaaben他们的反馈的手稿。手稿目前可用的预印本bioRxiv doi:https://doi.org/10.1101/2022.12.27.522029。
的利益冲突
所有的作者都是发明家在系统提交的专利Biocontainment策略。
出版商的注意
本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。
补充材料
本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fbioe.2023.1136095/full补充材料
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关键词:biocontainment、生物安全、益生菌酵母、微生物工程、S boulardii,肠道micobiome
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收到:2023年1月02;接受:2023年2月06;
发表:2023年2月20日。
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