原始研究的文章

前面。Bioeng。Biotechnol。,01 February 2023
秒。生物传感器和生物分子电子产品
卷11 - 2023 | https://doi.org/10.3389/fbioe.2023.1057216

癌症肿瘤的代谢特性允许歧视从白细胞label-free多通道光学成像

玛丽亚Mangini ¹ ^__,

玛丽亚Antonietta费拉拉 ² ^__,

布冯鸡头 ²,

斯特凡诺Manago ¹, www.雷竞技rebatfrontiersin.org

阿尔贝托Luini¹*,

安娜德卢卡奇亚拉 ¹*^‡和

朱塞佩•科波拉 ²*^‡

¹Biophotonics和先进的显微镜,研究所的实验室实验内分泌学和肿瘤学”G。塞尔瓦托”,第二单位,国家研究理事会,那不勒斯,意大利
²光学和光子学实验室,应用科学研究所和智能系统,那不勒斯单位,国家研究理事会,那不勒斯,意大利

循环肿瘤细胞(ctc)肿瘤细胞渗透循环系统的保护肿瘤性质和异质性。检测和表征CTC的高潜力的临床价值和许多CTC识别技术已经开发出来。这些方法仍然受到异乎寻常的罕见ctc和有效区分癌症的难度大得多的血液中白细胞的数量。因此,仍然是一个需要有效和快速的方法获取广泛的肿瘤细胞在血液中循环。这里,我们利用癌症代谢的特点从白细胞识别癌症。使用氘葡萄糖和拉曼显微镜我们显示)已知的肿瘤细胞对葡萄糖的能力大大增加利率而非癌症细胞的脂质生成和积累成脂滴,b)相反,白细胞不产生可见的摩门教的出现。LD丰度的差异,它提供了一个可靠的区分癌症和血细胞参数。LD敏感检测细胞中利率适合筛选目的,我们测试polarization-sensitive数字全息成像(PSDHI)技术检测的双折射性质摩门教。通过使用polarization-sensitive数字全息成像,癌细胞(前列腺癌,生物和肝癌细胞HepG2)可以迅速从白细胞歧视可靠性接近100%。结合拉曼和PSDHI显微镜平台奠定了基础的未来发展一个新的label-free,简单和普遍适用的癌症细胞的分离方法。

1介绍

检测循环肿瘤细胞的能力(ctc)的癌症患者的外周血液中可以利用生成微创诊断和预后的工具(Alix-Panabieres Pantel, 2016)。ctc是肿瘤细胞的一个子集,获得的能力传播从原发肿瘤和intravasate循环系统。如果从血液分离,他们可以培养和生理特点,肿瘤的发展,可以提供有价值的信息和预测病人的生存,在转移性大肠癌患者,乳腺癌、前列腺癌、肺癌、卵巢癌(把et al ., 2014;Rupp et al ., 2022)。CTC在外周血检查比传统微创活检,它可以被视为“液体活检”有可能监测疾病进展并确定在不同的患者的治疗选择,所以个性化医疗移动另一个一步(把et al ., 2014;Rupp et al ., 2022)。然而,技术开发的生物表征ctc挑战了这些细胞的非凡的罕见(每毫升的几个到数百全血)在大量的红细胞和白细胞分离的难度从大量的白细胞(白细胞)在血液中。由于这些原因,新方法不断提出,目的是提高识别和隔离ctc足够多数量和兼容条件下其分子和功能描述。当前使用的ctc识别方法依赖于肿瘤细胞的物理性质或生物标志物在肿瘤细胞表面的表达。虽然不是绝对可靠,几个物理性质区分ctc和正常的血细胞。这些包括大多数癌细胞的更大的规模和密度的差异,迁徙的属性,可变形性或电荷(Habli et al ., 2020)。filtration-based组成的这些方法,系统、离心或dielectrophoretic,提供一种快速而简单的方法对孤立CTC,与温和的选择性,但往往由于极其可变CTC大小或CTC聚集的形成。或者,可以分开ctc immunoaffinity方法基于生物标记在细胞表面的存在。到目前为止,唯一的食品和药品管理局批准了CTC隔离是一种immunomagnetic-based技术平台,CellSearch^®(Janessen诊断)(Habli et al ., 2020)。这种方法利用捕获agent-labelled磁珠的选择CTC的检测上皮细胞粘附分子(EpCam)表达了CTC表面。虽然这种方法是最标准化,现在正测试用于治疗临床应用,它遭受灵敏度相对较低。只有一小部分的转移性癌症患者得分积极ctc。事实上,并不是所有的肿瘤类型表达EpCam和EpCam表达式可能会丢失epithelial-to-mesenchymal过渡期间转移性癌症。由于这些原因,CellSearch^®通常仅用于一些选定的癌症类型乳腺癌、肺癌和前列腺癌(三峡et al ., 2012;Hyun et al ., 2016;Habli et al ., 2020)。因此,仍有相当多的临床需要一个高效和快速捕获整个不同光谱的血液中循环肿瘤细胞,其次是分子和功能描述。一个理想的场景是一个ctc的一个无偏低成本的检测和识别是一种快速和可靠的方式来进行,需要很少的操作示例(即。、血液)和非破坏性的方式。应对这种需求,我们首先确定小说morpho-functional参数表示不同的肿瘤细胞和白细胞用于有效识别这两种细胞类型。其次,我们提出了相关成像技术使这些参数的检测快速、敏感和非破坏性检测的可行的癌细胞。确定适当的独特的参数,我们依靠独特的癌细胞代谢特性包括葡萄糖的能力大大增加利率(5 - 10倍),而非癌症细胞(Warburg效应)和代谢葡萄糖在癌症特定的方式(华宝,1956;范德Heiden et al ., 2009)。Warburg效应目前在预后和诊断癌症成像技术的基础上,利用radio-labelled葡萄糖类似物。通常(¹⁸F] 2-fluoro-2-deoxyglucose (FDG)细胞内浓度测量通过正电子发射断层扫描(PET),通常利用在当地疾病的分期和评价。由于当地宠物信号从肿瘤细胞高于周围组织因为Warburg效应,这使得定位的异常细胞体内,揭示转移的存在,允许采用的肿瘤反应的评估治疗(刘易斯et al ., 2015)。这种方法,以及使用radio-labelled或荧光葡萄糖类似物,不能用于识别需要长和有毒的可行的CTC样本准备进一步阻碍CTC分子和功能描述。

在此,我们研究了葡萄糖吸收和新陈代谢的癌细胞使用氘葡萄糖(deut-Glc),这是一个与氘标记葡萄糖isotopologue碳,和Raman-based显微镜。氘标记可以作为高对比度产生拉曼振动(化学)标签带所谓的拉曼沉默区域的生物标本,即。,没有内源性分子贡献任何拉曼信号。因此,deut-Glc及其代谢物可以具体和敏感检测到拉曼显微镜(RM)。重要的是,与之前报道的葡萄糖类似物,deut-Glc生化反应的葡萄糖可以内化和代谢和细胞没有毒性作用(李和程,2017)。它可以被用来研究活细胞的动态过程在体外和在活的有机体内即使在长时间孵化(Gomathy et al ., 2010)。正如预期的那样,我们发现deut-Glc内化了癌细胞以更高的利率比正常细胞和白细胞,并代谢形成有效氘圆的胞质细胞器,直径几微米,显然被RM。拉曼光谱以及这些结构形态分析表明,脂滴(像)。这些发现与之前报道的研究评估LD数量的增加发生在细胞接受肿瘤进程(Petan et al ., 2018;克鲁兹et al ., 2020;Petan 2020)。相比之下,在白细胞脂滴几乎检测不到。因此,分离的基于拉曼检测c - d信号相比,癌症细胞的脂质滴白细胞原则上是可行的。然而,这种识别不能由RM筛选所需速度在几分钟,数以百万计的细胞由于有限的敏感技术。大癌症和白细胞之间的摩门教的丰度差异因此必须评估使用显微镜技术使收购视频速度速度。众所周知,摩门教是由高度拥挤和有序数组的胆固醇,甘油三酯、磷脂和表现出特定的光密度和双折射(Reginato et al ., 1985;Sturley侯赛因,2012;包蒂斯塔et al ., 2014;loannou et al ., 2019;王et al ., 2020)。为了检测这些光学特性,我们使用最近开发polarization-sensitive数字全息成像(PSDHI),允许与高灵敏度和速度测量的偏振状态的修改(SoP)偏振光的散射的样本,与拉曼信号(科波拉和费拉拉,2020)。此外,因为它是基于一种全息技术,它是定量,因此可以进行比较研究。另一方面,技术是快速和原则上数以百万计的细胞可以分析在几分钟。我们表明,使用这种技术,像癌症细胞可以检测并用于区分癌症细胞白细胞与可靠性接近100%,利率适合筛选的目的。

总之,由于结合拉曼和PSDHI平台(见图1 a, B)我们能够研究摩门教的deut-Glc吸收和随之而来的形成以癌细胞高速度(在肝癌、HepG2和前列腺癌细胞,生物),而白细胞甚至正常上皮细胞(PNT2)。癌症细胞,由于内化和代谢deut-Glc,显示出强劲的双折射信号,关联和colocalizes c - d拉曼信号很强,相比之下白细胞,在同一个deut-Glc条件,不表现出可测的摩门教的水平。因此,这些代谢特性的检测结合label-free和非破坏性喇曼和PSDHI-based方法允许区分肿瘤细胞和白细胞具有高敏感性和特异性。

图1

图1。为合并后的成像原理拉曼显微镜和偏振敏感数字全息术。(一)拉曼光谱的同位素标记葡萄糖(deut-Glc)在水溶液1 M透露一个拉曼乐队∼2120厘米左右⁻¹。c - d信号可以作为示踪剂葡萄糖摄取和形象化脂滴形成癌细胞。改变光的偏振观测到的只有在对应的脂质滴,由于这些微结构的光学旋转色散。(B)结合实验装置。(C)重建的振幅和相位映射的两个正交组件对象字段和对应的振幅比和相位差的地图。相位差的梯度地图报道是正确的。亮点对应于强双折射变化。比例尺:10μm。(D)拉曼代表的形象与deut-Glc HepG2细胞孵化。胞质为代表的红色,绿色和蓝色细胞核的脂质滴。下面的代表光谱细胞溶质,脂滴和核。氘信号在2120厘米⁻¹强烈可见脂滴谱。裸露的规模:5μm。(E)拉曼光谱的癌细胞(蓝线)细胞培养白细胞(紫色的线)。白细胞,c - d信号约2120厘米⁻¹是完全可以忽略不计。

2材料和方法

2.1样品制备

前七十二小时实验PNT2、生物和HepG2细胞被镀在CaF2 24-well板盖玻片在25000年,50000年和25000个细胞/好,分别。在细胞培养报告细节补充材料。八小时后电镀,介质被替换为新的介质由DMEM deut-Glc包含5毫米。后的第二天,5毫米、相关介质取代了介质包含2毫米、相关1 h。细胞被洗了三次PBS和培养1 h没有葡萄糖或特定的时间在一个中等含25毫米deut-Glc (李和程,2014每24 h。),新鲜培养基添加控制样品(CTRL) PNT2、生物和HepG2细胞培养都没有相关的1 h。在deut-Glc培养时间后,细胞被固定在室温下10分钟4% (v / v)多聚甲醛。

白细胞从血液健康的捐赠者被Ficoll-Paque梯度密度分离获得。细胞生存能力评估发现台盼蓝染料排斥和> 95%。白细胞/细胞系培养,24小时前WBC净化细胞系(PNT2,生物和细胞HepG2 1000 /)在CaF镀₂涂上了Poly-L-lysine。镀后的第二天,从血液白细胞纯化一起细胞系葡萄糖饥饿(从10毫升的血液白细胞纯化镀在每个)在一个中等deut-Glc包含25毫米。新鲜培养基添加每一个24小时和48小时后细胞被固定在室温下10分钟4% (v / v)多聚甲醛。为控制实验,经典、相关deut-Glc被替换下场。盖玻片CaF被密封₂幻灯片,使用常见的指甲油和拉曼和全息术进行性格特征。

2.2结合拉曼光谱和偏振敏感数字全息显微镜

拉曼光谱和图像是用一个反向使用532纳米的激光共焦拉曼(50 mW,氦氖)和一个×60水浸物镜(尼康,NA = 1.2, WD = 300μm)(见图1 b)。单色仪入射狭缝的是设定在100μm的光圈。光学分辨率,这样的设置在x - y平面约500海里,大约5μm沿光轴。在数据采集过程中,激光光束集中在脂滴。然而,这种散射光从不同的细胞等(即包含平均信息。、胞质膜)。激光激发功率样本2 mW,拉曼光谱是2 s积分时间。没有可见的细胞photodamage采用光学能量。删除后的拉曼光谱,宇宙射线,平均,背景校正与二阶导数方法通过创建一个基线,然后减去它的峰值在OriginLab分析器功能可用。拉曼形象被光栅扫描收购固定细胞通过激光焦点的步长0.5μm,和拉曼光谱获取数组的选择区域(曝光时间1 s轨道/频谱)。1500/2000光谱收集每个细胞。 Chemical maps (false colour Raman images) were generated by imaging the DNA peaks at 2,956 cm⁻¹和790厘米⁻¹核(蓝色信号),蛋白质乐队在2930和1100厘米⁻¹(红色信号)的胞质和c - d信号2120厘米⁻¹(绿色信号)的脂质滴使用HORIBA科学实验室规范6软件。

的双折射分析检查细胞线进行了使用激光线660海里(环形激光器,Max = 700 mW CW,相干长度≈100,偏振方向:垂直极化率> 100:1)所示图1 b。配置记录polarization-sensitive全息图由两个参考修改马赫-泽德干涉波(R1和R2)干扰对象梁(Obj) (Colomb et al ., 2002;Colomb et al ., 2003;帕拉西奥斯et al ., 2013;De旧金山et al ., 2019;科波拉和费拉拉,2020)。细节发表在补充材料。两个参考光束的正交性保证干扰对象之间只有光束和参考光束。此外,控制镜子M2和M3,两光束可以稍稍对传播对象的引用梁来获得一个离轴配置(见插图图1 b)。两组重叠的边缘模式是通过CCD (CCD1, Thorlabs DCU223M, 1024×768像素阵列;像素尺寸Δx =Δy = 4.65μm, fps = 30)和存储的精化。最后,两个参考光束的偏振调整,从而确保它们之间没有干扰和一个好的对比梁干涉条纹的对象,面向巨大打击波板在0和90°R1和R2中使用的武器(HWP2和HWP3),分别。

2.3 SoP评估数值重建的全息图

CCD面,全息图强度分布是:

H (x, y) = (O b j + R 1 + R 2) ∙ {(O b j + R 1 + R 2)}^{*} (1)

星号表示复共轭。假设R1 (R2)是沿着x (y)线性偏振方向,因此考虑到这些光束的正交性,即R1⋅R2 * = R1 *⋅R2 = 0,情商。1可以表示为:

\begin{array}{c} H (x, y) = ({|{O b j}_{x}|}^{2} + {|{O b j}_{y}|}^{2} + {|R 1|}^{2} + {|R 2|}^{2}) \\ + ({O b j}_{x} {R 1}^{*} + {O b j}_{y} {R 2}^{*}) + ({O b j}_{x}^{*} R 1 + {O b j}_{y}^{*} R 2) \end{array}

因此,收购了全息图的叠加三个方面在括号中:zero-diffraction秩序,虚拟映像,真正的图像。这些术语表现清晰可见的傅里叶变换全息图和报告这个频谱的振幅。事实上,参考光束倾斜的保证条款相对于对象(在括号中第二和第三项)从零级项是在空间上分开。

极化状态的对象字段的意义明确的表达的振幅(| Obj_x|和| Obj_y|)和相位变化(δxδy) x和y分量的几何结构参数如下:

\begin{array}{c} β = 反正切 (\frac{|{O b j}_{x}|}{|{O b j}_{y}|}) \\ ∆ ϕ = δ_{x} - δ_{y} + ∆ ϕ_{R} 。 \end{array} (2)

第一项有关的不同传播强度两个正交组件和对应的方位角偏振椭圆,而第二项包含不同的光学路径的信息由于细胞的折射率的各向异性。 ${∆ ϕ}_{R}$ 两者之间的相位差参考光束和可以被初步确定校准(Colomb et al ., 2003)。因此,评估对象的SoP梁沼生植物细胞的两个正交分量沿x和y方向需要检索。这些组件可以通过空间滤波算法用于重建传统的角谱方法(Colomb et al ., 2005;邱et al ., 2015;汉et al ., 2017;窦et al ., 2019)。特别是,每个对象的虚拟映像波束是正确空间过滤和乘以相关数字计算实验参考光束的复制品,例如:

\begin{array}{c} ({O b j}_{x} {R 1}^{*}) R_{N 1} \\ ({O b j}_{y} {R 2}^{*}) R_{N 2} \end{array} (3)

RN1 (RN2)的数值复制参考光束R1 (R2)。报告的方法邱et al。(2015)参考光束的应用找到副本尽可能接近实验的。的产品(3)允许将虚拟映像对傅里叶域中的起源和复杂对象字段由一个逆傅里叶变换可以检索。因此,数值可以执行反向传播的复杂对象检索字段(费拉拉et al ., 2015;邱et al ., 2015;费拉拉et al ., 2016)。这种方法允许重建以下字段:

\begin{array}{c} (|{O b j}_{x}| e^{我 δ_{x}}) {|R 1|}^{2} \\ (|{O b j}_{y}| e^{我 δ_{y}}) {|R 2|}^{2} \end{array}

考虑到两个参考梁实验调整具有相同的强度| 1 | | = | R2,报告的参数(2)可以很容易地评估。

唯一获得的图像是一个全息图(见补充图S1)通过光的推理新兴从细胞观察两个正交参考波。图1 c报告对象检索字段的一个例子两个正交的方向和相应的振幅比地图,相位差相位差地图的地图和梯度下的光束与细胞相互作用的观察。

2.4主成分分析拉曼数据和检索的SoP的全息图

为了比较结果在不同的葡萄糖培养时间为不同的细胞系,PCA。这一多元统计方法允许从直方图中提取相关信息变量和表达这些信息为一组新的正交变量用于识别相似/多元化模式的观察不同细胞的葡萄糖吸收。在细节,Matlab脚本,从每个全息图,地图相位差和幅度比正交分量的光束新兴的地图获取的细胞。从这些地图,只包含细胞被选中的区域。然后,总结生成直方图变量在特定灰度级的像素数量在相位差和振幅比的值。通过描述这些图像的像素强度直方图,得到两个数组的值和合并形成只有一个代表向量。此外,考虑到相位差分布可显著提高分类率(科波拉和费拉拉,2020),以下附加信息包含在这个向量:至少∆ϕ,最多∆ϕ,总∆ϕ和双折射区域归一化细胞的总面积。PCA是验证槽分析交叉验证过程和混淆矩阵建立了。从这个矩阵,“测试”特征,如:敏感性、特异性、准确性、阳性预测值(PPV)以及阴性预测值(NPV)进行评估。

PCA用于细胞的拉曼光谱分类使用分析交叉验证方法和验证。至于全息数据,我们得到了一个混淆矩阵,总结正确的和不正确的光谱分类。(Manago et al ., 2016)。

3的结果

3.1检测癌细胞识别的脂质滴

我们的目标是区分癌症细胞的白细胞通过分析癌症细胞葡萄糖hyper-uptake及其代谢物,系统化的图1。在癌细胞研究葡萄糖吸收,我们取代葡萄糖在细胞培养基中同位素标记葡萄糖([D₇]葡萄糖)。事实上,拉曼光谱(D₇]葡萄糖透露一个拉曼乐队∼2120厘米左右⁻¹代表性的拉曼光谱,可见的报道图1一个,从而占据了所谓的沉默的内源性分子的光谱区(因为生物分子中c - d生理上可以忽略不计)。因此,deut-Glc及其代谢产物可以在细胞特别敏感地检测和成像RM。HepG2细胞首先调查,因为他们展示高水平的相关吸收葡萄糖代谢和被广泛用作模型研究。HepG2细胞培养48 h的deut-Glc(25毫米),然后由RM成像。一个代表性的成像实验中所示图1 d。一个二维数组的拉曼光谱(约2500光谱每个细胞)收集在一个包含细胞的选择区域。为每个像素的步长0.5μm信号收集1 s的曝光时间。光谱从细胞核,胞液和颗粒细胞表现出特定的乐队对应蛋白质、脂类、碳水化合物、核酸指纹区。光谱的指纹区域的特点是强烈的乐队在1100 - 1300厘米⁻¹之前与酰胺三世,1450厘米⁻¹在蛋白质)和1660年(碳氢键变形厘米⁻¹(酰胺)(Zoladek et al ., 2010)。拉曼乐队与氨基酸可以可视化在1003厘米⁻¹(phenilanalyne), 850厘米⁻¹(酪氨酸)。拉曼乐队在790厘米⁻¹代表主要存在于细胞核DNA。这些乐队之前报道的初步分配(Notingher Hench, 2014;Manago et al ., 2018)。通过成像DNA在2956年达到顶峰,790厘米⁻¹(蓝色信号),蛋白质乐队在2930和1100厘米⁻¹(红色信号)和c - d信号在2120厘米⁻¹(绿色信号),我们重建一个细胞的化学地图假色标。在细胞胞质,亚细胞圆的细胞器显示特定的信号在2000 - 2200厘米⁻¹与c - d。c - d喇曼带的存在和强大的乐队在2850厘米⁻¹与脂质(胆固醇、甘油三酯、磷脂)和他们的典型的大小约μm表明这些圆的对象是脂滴(李和程,2014)。这些观测结果表明,在我们的实验条件,如预期的那样,优先使用deut-Glc癌症细胞的脂质合成然后存储在摩门教。作为一个控制,未发现c - d标签滴在细胞培养not-deuterated葡萄糖。

我们进一步问超吸收和积累的葡萄糖可用于识别肿瘤细胞和白细胞的歧视。为此,白细胞分离从血液健康的捐赠者使用聚蔗糖梯度离心协议,一起镀HepG2细胞(见材料与方法部分)和孵化deut-Glc 48 h。图1 e报告的拉曼光谱获得HepG2细胞溶质,特别是从脂滴,Δt = 48小时而从白细胞获得的信号。很低的拉曼信号的光谱区约2120厘米⁻¹可以观察到在白细胞的光谱,同时,正如所料,c - d乐队在光谱HepG2细胞信号强烈明显。因此,葡萄糖的hyper-uptake癌细胞和使用稳定同位素标记葡萄糖可以作为示踪剂来可视化的RM许多摩门教的存在癌细胞,这可以利用从正常细胞区分ctc。然而,拉曼成像技术通常需要长时间收购,它并不总是适合建立筛选策略。

检测的标准协议摩门教的细胞中它是基于使用荧光团(油红O或Bodipy)适合选择性染色和检测培养细胞的中性脂质。然而,所有的细胞膜产生荧光背景信号,可以掩盖,一般来说,影响摩门教的敏感性和特异性的检测。在此,我们建议使用一个特定的和选择性的摩门教,非常密集的脂质微观结构与特定的光学性质,例如,高双折射度(包蒂斯塔et al ., 2014)。基本上,细胞膜胆固醇和磷脂成分的变化导致生化和双折射变化检测与数字全息成像偏振敏感。PSDHI已经证明是一个快速的技术允许的分析所有的细胞在显微镜视野一枪(科波拉和费拉拉,2020)。PSDHI系统已经用于可视化和监测细胞内光的偏振状态的函数、相关内化和关联信息拉曼形象。对于一个固定的光学路径长度,观察线性偏振的偏振面旋转输入光束光学活性的样品的浓度成正比。基本上,PSDHI提供矢量干涉图的空间分布呈现SoP修改对均匀输入,因为与标本的交互。事实上,它提供了一个非侵入性的定量估计相位差和振幅之比的正交分量的光束通过收购一个全息图像。图1 c的地图显示相位差∆ϕ和振幅比β允许突出细胞内的地区检测到SoP的变更。此外,压力相位差信息,在细胞识别上述地区,相位差值梯度的规范(空变)∇∆ϕ也计算,报道图1 c,地点:

\nabla ∆ ϕ = \sqrt{{(\frac{\partial ∆ ϕ}{\partial x})}^{2} + {(\frac{\partial ∆ ϕ}{\partial y})}^{2}}, (4)

在这 $\frac{\partial ∆ ϕ}{\partial x}$ 和 $\frac{\partial ∆ ϕ}{\partial y}$ 偏导数的相位差对x和y。

提供的空变偏振信息的成像分析PSDHI RM和空变生化信息提供的高光谱图像在同一细胞(HepG2 deut-Glc 48 h)报道图2 f。通过比较图像获得的RM和PSDHI,它变得明显的c - d拉曼信号之间的空间相关性和双折射的本地化,由于葡萄糖分析细胞内化和脂滴的形成。因此,生化RM所提供的信息由PSDHI与偏振相关变化。

图2

图2。HepG2细胞成像和葡萄糖吸收动力学。(一)亮视场图像HepG2细胞。(B)c - d频带信号的拉曼图(C)重建的假彩色喇曼形象使用DNA喇曼乐队在2956厘米⁻¹和785厘米⁻¹核(蓝色信号),蛋白质乐队在2930厘米⁻¹和1100厘米⁻¹胞质(红色信号)和c - d乐队在2120厘米⁻¹(绿色信号)的脂质滴。每个像素的曝光时间是1 s轨道。(D)相位差;和(E)相应的相位差由PSDHI梯度地图检索。(F)合并后的c - d频带信号的拉曼图形象和相位差图PSDHI地图,评估了c - d信号的脂滴和SoP变化。比例尺:10μm(G)图表显示了氘峰值强度HepG2细胞治疗25毫米deut-Glc 2, 12、24、48和72 h。数据显示三个独立实验的平均数±标准差。插入了摩门教的意思是拉曼光谱HepG2细胞治疗25毫米deut-Glc 48 h。(H)HepG2细胞系的相位差在辐射范围处理25毫米deut-Glc 2、24、48和72 h。数据显示三个独立实验的平均数±标准差。在插图,相位差梯度报道。酒吧是5μm规模。敏感性和特异性获得PCA对拉曼数据集(我)和PSDHI数据集(J)。

3.2动力学的摩门教的拉曼和PSDHI HepG2细胞形成

摩门教的动态形成deut-Glc吸收诱导的评估,通过拉曼光谱和SoP HepG2细胞的函数deut-Glc潜伏期超过3天的时间窗口。细胞培养的一组观测时间,Δt, deut-Glc孵化,特别是2,24日,48岁,72 h。控制(CTRL) HepG2文化一直在细胞中没有1 h葡萄糖。每组拉曼和PSDHI实验重复了三次,以确保每部分进行重复性和大约90个细胞。图2 g报道的强度c - d乐队∼2120厘米左右⁻¹对HepG2的拉曼光谱获得与deut-Glc孵化时间的函数。插图显示了平均拉曼光谱获得HepG2的脂质滴Δt = 48 h。24小时后,我们观察到摩门教的形成,因此c - d细胞内的信号变得可见。c - d信号从24到48 h(增加孵化deut-Glc然后(见减少补充图S2)。PSDHI实验上执行相同的HepG2细胞相同的条件。第一个有用的参数相位差的传播,测量全息图的最大范围相变异∆ϕ观察细胞Δt的函数。的平均范围∆ϕ是定量报告图2 h和清楚地显示了一个从2增加到48 h葡萄糖孵化。在葡萄糖,48 h后出现饱和。目视检查的结果(见地图补充图S3)显示密度的增加热点的特征相关的相位差∆ϕ和∇∆ϕ孵化时间超过24小时。这些热点似乎更相关的外围细胞和在特定积累点,恰逢摩门教(包蒂斯塔et al ., 2014),如所示图2 f。至关重要的是,HepG2细胞培养与非氘、相关(相同浓度的25毫米超过3天的孵化窗口),正如所料,PSDHI比同deut-Glc分析显示相同的结果,确认D-to-H替换不影响吸收动力学。

为了定义RM和PSDHI测量的效率和灵敏度检测癌细胞的摩门教的形成,利用主成分分析法(PCA)进行统计分析。因为它可以观察到补充图S4PCA分析拉曼数据集上执行提供电脑载荷谱显示c - d地区差异以及指纹区与deut-Glc CTRL细胞间和细胞培养48 h。分类敏感性和特异性进行评估的孵化时间如表所示报道图2我。因为提供的拉曼光谱信息不仅在c - d债券,但总体平均分子状态的细胞对其生理状态,原因显而易见PCA显示变异CTRL(饥饿状态)细胞和细胞之间也喂2 h,虽然不是意义明确的归因于c - d喇曼乐队。

类似的多元统计分析进行了直接β和∇ϕ地图。同时,其他hologram-inferred参数考虑材料和方法部分中描述。HepG2的多元分析数据集对于每个Δt使用前三个主成分(电脑₁,电脑₂,电脑₃)方差约占88%,9%,和2%,分别。PCA允许我们识别模式的多样性HepG2细胞治疗相关的多样化的潜伏期。总结了相应的敏感性和特异性图2 j结果明确指出,一个优秀的辨别能力以及各种观察Δt值高达100%。这些数据明确地表明PSDHI能够跟踪、相关的光学微扰诱导的细胞吸收和新陈代谢。

此外,RS和PSDHI信息与孵化时间和最高的信息检测与deut-Glc 48 h后的治疗。

3.3数据像形成癌症细胞和白细胞的歧视

一旦Glc-uptake监控的结合方法证明,RM和PSDHI分析进行癌症细胞和白细胞。然而,定义的时间和动态分化,我们初步的进行在体外实验与癌症细胞,生物(或HepG2)和非癌症细胞,PNT2,源于相同的前列腺组织。氘拉曼信号显然是只发现在癌症生物细胞,类似于HepG2细胞(图3一)。事实上,c - d峰可见从Δt = 24小时的治疗在48小时最大癌细胞。c - d乐队显然是低PNT2细胞的拉曼光谱,光谱的报道图3一。相同的正常和肿瘤细胞被PSDHI分析。从视觉分析的初步结果,增加密度的热点明显相位差是观察肿瘤细胞而非癌症细胞(见图3 b)。

图3

图3。在癌症和非癌症细胞Deut-Glc吸收动力学。(一)c - d拉曼强度乐队正常PNT2(绿色三角形)细胞和癌症生物(灰色圆圈)和HepG2细胞(蓝色平方)处理25毫米deut-Glc 2、12、24、48和72 h。相应的平均拉曼光谱PNT2(绿线)、生物(灰色线)和HepG2细胞(蓝线)处理25毫米deut-Glc 48 h另外显示。(B)相位差Δϕ,振幅比β和相位差的梯度地图∇Δϕ癌症生物和非癌PNT2细胞株对待deut-Glc 48 h。比例尺:5μm。PCA分析比较PNT2和生物细胞系。趋势的敏感性(绿色圆圈),特异性(紫色的钻石)和准确性(蓝色平方)获得在不同葡萄糖孵化时间拉曼数据(C)和PSDHI数据集(D)。

此外,这些热点的数量增加而Δt提供差异化的能力增加。如前所述HepG2细胞,这些热点似乎主要位于摩门教。评级生物和PNT2结果与同HepG2细胞,数量最多的地方还是HepG2细胞中发现,正如所料,因为他们表现出更明显、相关吸收。β的一个例子,∆ϕ,∇∆ϕ地图获得PNT2和生物细胞Δt = 48 h中说明了图3 b。考虑放大所需colourbars PNT2成像,有明显的定量差异PSDH地图的生物和PNT2细胞。事实上,如果相同的颜色栏用于PNT2和生物细胞,生物地图会出现完全黑色。重要的是,∇∆ϕPNT2细胞显示了微不足道的热点地图,48 h与deut-Glc孵化的,产生的背景噪音水平相比,周围的浴,指出相关的相关性hyper-uptake癌症的重要光学微分。对于癌细胞(生物),我们观察到的范围增加∆ϕΔt越来越广。这些结果证实的发生率、相关hyper-uptake独家双折射的癌细胞。图3 c显示的结果进行PCA分析拉曼光谱数据集比较生物和PNT2细胞。作为一个控制(CTRL),细胞在细胞中没有保持1 h葡萄糖。混淆矩阵得到使用分析交叉验证过程和敏感性,特异性和准确性进行评估的所有分析deut-Glc孵化。deut-Glc治疗48小时显示最好的表演提供了100%的准确率。PCA也表现在子集(HepG2比PNT2)和(HepG2比生物)Δt的函数。结果细胞培养48 h deut-Glc和报告的CRTL细胞表1,突出最佳的三种细胞类型之间的歧视实现,基于c - d光谱区和指纹区甚至CRTL细胞。PCA分析PSDHI数据集,在报道图3 d显示,Δt = 48 h最高的可重复性和准确性(大约90%)区分正常和肿瘤细胞。为了速度Glc-uptake发病率在全息分析,主成分分析也表现在子集(HepG2比PNT2)和(HepG2比生物)Δt的函数。敏感性,特异性和精度获得最重要的情况下,例如Δt = 48 h和CTRL细胞,进行了总结表1。

表1

表1。PCA分析拉曼数据集和PSDHI数据集比较分类的敏感性、特异性和准确性对HepG2 vs PNT2和HepG2 vs生物在deut-Glc 48 h和CRTL细胞。

基本上,在最大分化达到Δt = 48 h,与PCA进行拉曼数据协议,这项技术可以成功区分两个癌症细胞系的正常精度(97%)以及HepG2细胞对生物细胞之间(约90%的效率),只有根据不同的光学响应表现为相关的表型hyper-uptake葡萄糖。这些结果,一起观察推导出的拉曼分析,确认label-free检测葡萄糖的吸收及其代谢物可以成功利用区分癌细胞与非癌症细胞。

最后,白细胞分离血液健康的捐赠者一起镀与生物细胞或HepG2细胞孵化deut-Glc 48 h。图4 a, B拉曼光谱和PSDHI实验报告。PSDHI证实白细胞没有显示显著差异SoP也与deut-Glc 48 h的孵化后,和一个非常低的拉曼信号光谱区约2120厘米⁻¹可以观察到。的确,白细胞显示低deut-Glc摄取率,从而降低生产摩门教的相比,生物细胞或HepG2细胞。此外,PSDHI地图对于癌症细胞系透露几个亮点的双折射摩门教的同时培养白细胞出现全黑。

图4

图4。PSDHI HepG2的拉曼分析和生物细胞培养健康献血者外周血的白细胞孤立存在25毫米deut-Glc 48 h。(一)拉曼光谱的生物(灰色线),HepG2(蓝线)细胞培养白细胞(紫色的线在图)。(B)PSDHI地图共培养的肿瘤细胞和白细胞。较小的白细胞没有显示出明显的双折射变化相比HepG2和生物癌症细胞系。(C)结果的分类算法通过拉曼和PSDHI HepG2的数据集和生物细胞培养白细胞。

我们进行PCA分析拉曼和PSDHI数据集(约300个细胞实验进行分析和实验重复了3次)来评估性能提出了癌细胞的识别协议。混淆矩阵建立了拉曼光谱数据在deut-Glc 48 h后,基于指纹区和c - d光谱区,导致100%的敏感性和良好的特异性和准确性参数白细胞和癌细胞之间的歧视,如所示图4 c。PCA也获得的数据集上执行分析白细胞的SoP,生物和HepG2细胞在同一deut-Glc培养时间(Δt = 48 h)和指出一个优秀的歧视能力高达99%完全基于LD双折射。在报道图4 c100%,阳性预测值(PPV)是癌症细胞类型和阴性预测值(NPV)为96%和98%,分别为生物和HepG2。重要的是指出PSDHI结果所有细胞(300)从图像中获得了与一个fps强加的相机使用(在我们的例子中约30 fps),从而使该方法与筛选应用程序兼容。进一步改善很容易设想通过增强双折射信号由于癌细胞有效的脂肪生成机制,例如细胞暴露在筛选前十八烯酸在短时间内。

4讨论

当前癌症细胞的方法检测和利用生物特征仍然受到CTC非凡的稀有以及从背景中分离CTC血细胞的困难人口与满意的灵敏度和可靠性。一般来说,相结合的方法用于删除unnucleated细胞,丰富ctc人口和识别/研究它们(Sharma et al ., 2018)。然而,仍然是一个伟大的临床需要有快速、通用、敏感和非破坏性歧视的生活从血液中白细胞ctc。

基于这些考虑,我们提出一个新颖的策略区分癌症细胞和白细胞依赖特定癌细胞代谢特性的检测。我们发现肿瘤细胞(细胞HepG2和前列腺癌,肝癌生物),美联储与葡萄糖生成并结合细胞膜脂质在摩门教和更有效地比非癌症。这是与之前报道的研究评估,癌症细胞含有丰富的脂质滴功能作为水库的能量和分子组件支持癌症发展(Hyun et al ., 2016;梅洛和韦勒,2016;耿和郭,2017;金,2020元,)。摩门教的之前,癌症生物标记和LD-associate蛋白过表达在大多数如果不是所有癌症细胞包括结肠癌、肺癌、皮肤、乳腺癌、前列腺癌、肝、肾、脑、卵巢癌和宫颈癌(克鲁兹et al ., 2020;渐变Kaiser et al ., 2022)。相比之下,我们发现白细胞似乎最有效LD生产商在所有的细胞类型进行测试。白细胞包含几个小,几乎无法觉察的摩门教(1 - 5摩门教/细胞),即使在病原体入侵或过敏反应的一些类白细胞可以积累更多摩门教,数量、大小和组成这些仍然非常不同于癌症细胞(Koizume宫城,2016;韦勒,2016;传统et al ., 2017;渐变Kaiser et al ., 2022)。因此,LD在癌症细胞丰度代表一个通用参数,可以用于有效地识别癌症从血液细胞(克鲁兹et al ., 2020)。

因此,使用一个成像平台结合拉曼成像和PSDHI我们成功地解决了第一个实验挑战强制开发这样一个label-free癌细胞评估方法基于摩门教的检测由于相关hyper-uptake。

第一个组件,拉曼光谱,由于其化学特性,适用于代谢研究和初步表征的LD的形成。我们已经研究了葡萄糖吸收及其代谢物在癌症细胞利用葡萄糖模拟与氘标记(deut-Glc),产生拉曼带约为2120厘米⁻¹。如果比较经典的PET示踪剂或荧光葡萄糖类似物,deut-Glc最小的结构修改,不会影响内化和代谢的细胞,它可以用来研究活细胞的动态过程(李和程,2017)。拉曼光谱成像HepG2细胞被用来定位和图像c - d信号从孵化deut-Glc 48 h后的吸收。c - d的本地化特定信号的颗粒面积大约1μm一起强大的乐队在2850厘米⁻¹与脂质相关表明,正如所料,葡萄糖吸收主要导致脂滴的形成(李和程,2014)。先前的研究已经报道了葡萄糖代谢合并使用isotope-labelled葡萄糖与拉曼成像像技术(李和程,2014)。然而,他们并没有研究特定的葡萄糖摄取活动在癌症和白细胞。在此,我们观察到一个非常低的拉曼信号谱地区约2120厘米⁻¹白细胞,的确显示,低利率的摩门教的生产(梅洛和韦勒,2016;韦勒,2016;渐变Kaiser et al ., 2022)。

第二个关键组件是PSDHI显微镜。尽管RM能够给特定生化deut-Glc信息内容及其代谢物在癌症细胞,可以用来区分癌症和白细胞或描述摩门教的化学成分,这是一个技术要求长时间收购,因此,无法分析10⁷细胞。这种限制可以部分地克服与不同的方法,选择和成像单拉曼乐队,提高拉曼信号收集或使用汽车、爵士等一些例子(爱伯哈et al ., 2015)和/或结合拉曼分析与微流体(Schie et al ., 2018)。在此,我们提供的相关的拉曼信息与双折射分析PSDHI。我们先前的研究证明成功的可能性,使用拉曼和PDSHI-based方法,肝素诱发等label-free可视化生物事件的精子获能精子细胞,通过双折射和化学变化由于精子脂质结构和组成(Colomb et al ., 2005;费拉拉et al ., 2015)。在这项研究中,通过定量估计的相位差和振幅的比值的正交偏振光束的组件与癌细胞,交互PSDHI本地化最强的双折射变化在脂滴。事实上,之前已经报道过的命令组成摩门教的可以改变的交互与偏振光(Reginato et al ., 1985;Sturley侯赛因,2012;包蒂斯塔et al ., 2014;李和程,2014;loannou et al ., 2019;科波拉和费拉拉,2020;王et al ., 2020),我们证明了它可以敏感地检测到PSDHI。HepG2细胞地图拉曼和PSDHI成像提供了明确的deut-Glc吸收之间的相关性,c - d信号的定位在脂滴和空变偏振定量PSDHI所提供的信息。

癌细胞(肝癌HepG2和前列腺癌生物细胞),SoP变化,以及c - d信号,增加了增加孵化时间与deut-Glc 48 h。48 h后治疗deut-Glc SoP的强烈变化,局部脂滴和与c - d最高的拉曼信号,显然是发现了。长潜伏期没有进一步增加SoP和c - d信号,表明脂质存储达到一个平衡的状态在72 h。另一方面,PNT2正常细胞和白细胞节目微不足道的双折射热点和非常低的c - d信号与deut-Glc 3天的孵化。

在deut-Glc 48 h的孵化后,PSDHI方法允许快速区分白细胞和癌细胞(即生物的全部和HepG2) PPV的100%和NPV值约97%,完全是基于LD双折射。在我们的战略,从单一量化PSDHI全息图可以允许快速筛查数以百万计的细胞视频的速度,因此,可以提供一个CTC morphology-based浓缩协议隔离,可以用来去除大部分的白细胞。细胞膜PSDHI的一大优点是,虽然可以用氘标记(癌症和正常细胞)或荧光探针,他们没有显示双折射,这消除了潜在的令人不安的背景信号从白细胞膜。重要的是,PSDHI检测白细胞和癌症之间允许良好的分化细胞在t = 0时,已经没有任何氘葡萄糖孵化。事实上,双折射信号只取决于从摩门教的存在,而不是从c - d信号。因此,癌症细胞的歧视白细胞可以避免长时间孵化与葡萄糖。在这最后一种情况下,LD双折射检测协议的性能可以进一步放大和加速了细胞暴露在筛选前十八烯酸在短时间内,由于癌细胞有效的脂肪生成机制。另一方面,拉曼光谱可以提供交叉验证PSDHI孤立的细胞以及提供一个深入生化细胞由PSDHI排序方法的调查。的确,高的化学特定性质的拉曼方法(Manago et al ., 2016)可以用来进一步提高分离效率PSDHI预滤器细胞。

拟议中的癌细胞检测方法提供了敏感(99%)和特异性(99%)识别癌细胞的重要优势,相比CellSearch®ctc方法,不依赖于特定癌症细胞表面标记物的表达。事实上,CellSearch的敏感性^®系统很大程度上取决于癌症的类型分析值在50% - -60%的范围(Galletti et al ., 2014;Satelli et al ., 2015)。基于CTC物理特性的检测方法显示敏感性与我们的系统但关键限制细胞的进一步分析样品(Galletti et al ., 2014;Satelli et al ., 2015)。

拟议中的协议可以应用于多种癌症类型(克鲁兹et al ., 2020;渐变Kaiser et al ., 2022)。事实上,我们表明,生物识别的效率和HepG2细胞白细胞是可比的,原则上,它可以转换成其他类型的癌症。我们的组合技术处理葡萄糖代谢,癌症细胞的形态学和生物化学(拉曼指纹),因此考虑所有这些参数我们可以区分HepG2和生物(两种类型的癌细胞显示类似的葡萄糖代谢)具有灵敏度高,原则上,我们可以区分癌细胞和其他罕见的细胞存在于血液。然而,应做进一步分析评估这个问题。

获得的结果的可靠性和可重复性奠定基础的发展一个新的label-free癌细胞检测方法能够识别一个可行的癌细胞通过利用其代谢异常特征从液体活检。

的label-free性质重要的是要注意,我们的技术和减少样本操作要求允许随后收集和在体外文化评估癌细胞遗传和生化特征或检查特定的药物敏感性的拉曼光谱或者其他生化方法。尽管有这些重要成果,实现更高的排序吞吐量的挑战依然存在。为此,它需要增强拉曼和PSDHI检测灵敏度,以及集成光学、微流体和信号处理。

数据可用性声明

原始数据支持了本文的结论将由作者提供,没有过度的预订。

作者的贡献

艾尔和ACDL构思的想法氘葡萄糖和脂滴Raman-based CTC的隔离;乘加、广州和GC全息实验怀孕的;MM、加和SM进行数值分析并进行了实验。作者分析了所有数据和准备。

资金

这项工作是财务支持的意大利癌症研究协会(现IG给予21420),坎帕尼亚地区(2014 - 2020年坎帕尼亚FESR普拉特和西罗)。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

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补充材料

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缩写

ctc,循环肿瘤细胞;CTRL,控制细胞;deut-Glc氘葡萄糖;DMEM,杜尔贝科′修改鹰′年代中;EpCam,上皮细胞粘附分子;帧,帧/秒;摩门教,脂滴;PBS,磷酸盐;主成分分析,主成分分析(pc₁:第一主成分,电脑₂:第二主成分的电脑₃:第三主成分);宠物,正电子发射断层扫描;PSDHI polarization-sensitive数字全息成像;RM,拉曼显微镜;SoP,极化状态;白细胞,白细胞。

引用

Alix-Panabieres C。,和Pantel, K. (2016). Clinical applications of circulating tumor cells and circulating tumor DNA as liquid biopsy.癌症。6 (5),479 - 491。doi: 10.1158 / 2159 - 8290. - cd - 15 - 1483