原始研究的文章

前面。Bioeng。Biotechnol。,18January 2023
秒。组织工程和再生医学
卷10 - 2022 | https://doi.org/10.3389/fbioe.2022.1003861

脱细胞血管骨移植:初步在体外猪模型的生物工程移植骨轴

Guillaume鲁吉尔 ^1、2 ^__,

路易Maistriaux ^1、3*^__,

谎言Fieve ¹,

Daela Xhema ³,

罗宾分离出来 ^3、4,

朱莉的魔鬼 ^1、4, www.雷竞技rebatfrontiersin.org

拉斐尔Olszewski^4、5,

法比安Szmytka ⁶,

尼古拉斯Thurieau ⁶, www.雷竞技rebatfrontiersin.org

琼Boisson⁶, www.雷竞技rebatfrontiersin.org

Natacha Kadlub^6、7,

皮埃尔Gianello ³,

凯瑟琳Behets ¹和

Benoit Lengele ^1,8

¹极形态(MORF)研究所的实验和临床研究(IREC) -UCLouvain,比利时布鲁塞尔
²肿瘤和Cervicofacial重建外科、耳鼻喉科学颌面部Surgery-Institut居里,巴黎,法国
³极实验手术,移植(CHEX)研究所的实验和临床研究(IREC) -UCLouvain,比利时布鲁塞尔
⁴Neuromusculoskeletal实验室(NMSK)研究所的实验和临床研究(IREC) -UCLouvain,比利时布鲁塞尔
⁵颌面外科和Stomatology-Cliniques大学医疗Saint-Luc,比利时布鲁塞尔
⁶IMSIA, ENSTA巴黎,巴黎综合理工学院研究所,Palaiseau,法国
⁷颌面部和重建Surgery-Necker年龄过病,巴黎,法国
⁸部整形Surgery-Cliniques大学医疗Saint-Luc,比利时布鲁塞尔

介绍:持久的关键尺寸的骨缺损重建仍然是一个手术挑战尽管许多自体和替代骨选项的可用性。在本文中,我们调查了创建一个活骨移植的可能性,使用灌注/去细胞/ recellularization (PDR)技术,是应用于血管猪骨移植物的原始模型。

材料和方法11:猪骨前肢,包括半径和尺骨,收获连同他们的脉管系统包括骨间动脉,然后使用顺序洗涤剂灌注脱细胞协议。血管细胞间隙,细胞外基质(ECM)和保存的生物力学属性进行评估。cytocompatibility和在体外有潜力的非细胞细胞外基质研究了静态播种NIH-3T3细胞和猪脂肪间充质干细胞(pAMSC),分别。

结果:成功脱细胞血管骨移植,一个优秀的3 d形态和ECM微体系结构的保护。测量的DNA和ECM组件显示完整的细胞间隙和保存的ECM的主要蛋白质。骨矿物质密度(BMD)的收购显示轻微,但非重要,减少去细胞后,虽然生物力学测试修改的。锥束ct (CBCT)收购后血管注射硫酸钡证实血管网络的保护在整个贪污。的可降解支架被证明非常低的残余十二烷基硫酸钠(SDS)在ECM和证实了成纤维细胞的高生活/死比播种后骨膜和骨ECM-grafts 3、7和16天的文化。此外,细胞增殖试验表明一个重要的种子细胞的增殖数量在同一端点。最后,使用pAMSC分化研究证实ECM贪污的潜力,促进成骨分化。pAMSC培养时发生了osteoid-like沉积在骨骼ECM增殖和成骨分化的媒体。

结论:完全脱细胞骨移植可以通过灌注去细胞,从而保护ECM架构及其血管网络,促进细胞生长和分化。这些血管脱细胞异体骨轴从而未来真正的潜力在活的有机体内再植术。因此,他们可能会提供新的视角对骨缺损修复和骨组织工程。

1介绍

大骨缺陷通常导致创伤性物质的损失,主要或次要骨肿瘤手术切除,败血症或整形外科畸形矫正手术Anract et al ., 2014;罗迪et al ., 2018)。重建仍然是一个挑战,尽管各种技术选项的可用性和骨替代品在当前的外科实践(Balogh et al ., 2012)。事实上,这些重建可以以不同的方式处理,根据位置,病因,病人的病情,如下:传统技术包括自体骨移植(太阳et al ., 2019),假体手术(Ogura et al ., 2018;静态et al ., 2020)、高膜感应二次接枝(Masquelet Begue, 2010;Giannoudis et al ., 2016;Sivakumar et al ., 2016)、显微外科重建(Pederson Grome, 2019;Bibbo 2021)、牵引成骨(Lesensky和王子,2017这些(的),或者一个组合妞妞et al ., 2011;胡本et al ., 2019;康et al ., 2020)。然而,所有程序都与几个缺点。事实上,自体骨移植和显微外科转移,诱导供体,发病率(Mauffrey et al ., 2016;Morelli et al ., 2016;火花et al ., 2017),而大假体植入背负感染或植入失败(Anract et al ., 2014)。倾斜使用人类异体骨去细胞后一步或没有银行处理目前用于重建小型或大型骨缺陷,从而保持一个近乎完美的生物力学宏观和微架构(Delloye et al ., 2007)。然而,许多研究都强调一个失衡的爬行替代同种异体与固有的并发症的缺乏适当的脉管系统,例如,应力性骨折,没有工会,感染,或吸收(Delloye et al ., 2007 b;Delloye角,2003)。尽管添加osteo-inductive因素或干细胞促进osteointegration可能有前途,仍然缺乏临床证据的有效性(卡斯滕et al ., 2008;Dumic-Cule et al ., 2015;Garcia-Gareta et al ., 2015)。因此,骨替代品和生物材料已经经历了许多调查,代表最探索和具有挑战性的领域之一,在组织工程(Delloye et al ., 2003;唐et al ., 2016;王et al ., 2018;张浩et al ., 2019;Abdollahiyan et al ., 2020)。这些材料构成重大战略选择不管他们的严厉要求,包括缺乏免疫排斥的情况下,完美的生物相容性、力学性能,以及他们的能力发展neo-angiogenesis,后者被持久osteointegration至关重要。

理想的替代品必须易于使用和处理,和生产价格适中,同时显示一个结构类似的矿化细胞外基质(ECM)包括有因素和结构组件。此外,近期作品在骨膜再生和软组织重建大骨架缺陷凸显出生活组织周围的骨osteointegration确实发挥了突出作用(Masquelet Begue, 2010;鲍德温et al ., 2017)。最近的出版物关于打印的骨突与综合分析水凝胶材料(Anada et al ., 2019)提高了伟大的希望的3 d打印的骨替代品的恢复潜力。但直到现在,他们没有达到一个足够大的规模与解剖设计和适当的组织成功植入的关键临床条件下(Arealis Nikolaou, 2015;Ravnic et al ., 2017;比达尔et al ., 2020)。持久osteointegration的关键是立即功能性血管内的骨骼替代,无法获得外部的背景下,传统的器官移植(王et al ., 2018;Zhang et al ., 2018;张锐意进去et al ., 2019)。输入的一种内在的脉管系统提供最佳的血液供应整个骨轴仍然是终极挑战来解决。此外,最近的报告表明,组织工程技术,如灌注/去细胞/ recellularization (PDR)过程中,允许生成3 d非细胞ECM支架保留血管树。这些非细胞矩阵可以播种与特定的自体的细胞再生功能,生物相容性和可移植的移植物(奥兰多et al ., 2013)。这些过程在器官字段(第一次描述了奥特et al ., 2010,2008年;Uygun et al ., 2010;奥兰多et al ., 2012;Mirmalek-Sani et al ., 2013),后来应用于广泛的动物和人类血管复合组织或解剖单元(闪避et al ., 2017,2015年;Duisit et al ., 2018 b;2018年,一个,2017年;Gerli et al ., 2018;莫泽et al ., 2020;伍斯里奇et al ., 2020)。虽然non-vascularized去细胞异体骨已被广泛描述在组织工程或临床生物(Blaudez et al ., 2020),这种灌注策略迄今为止从未被应用到整个长骨头。

在这个报告中,我们描述了第一个大型动物模型perfusion-decellularized植骨,这是收获的猪骨间的椎弓根的前臂和血管。细胞间隙、ECM和血管树保存,以及脱细胞骨移植的力学性能,进行了评估。最后,非细胞骨膜和骨基质与NIH-3T3细胞,被播种,论述非细胞骨ECM的属性进行了研究后的静态播种猪脂肪间充质干细胞(pAMSC)。

2材料和方法

所有实验都是当地伦理委员会批准UCLouvain(比利时布鲁塞尔)和实施按照比利时(皇家法令,2004年9月)和欧洲立法问题(指令- 2010 - 63)关于动物用于实验。

2.1收获技术

猪前肢从11岁之间的女性长白猪猪收获6和10个月大(平均体重:85.2公斤)用于实验的另一个研究小组在实验室,之后由氯化钾(氯化钾)注射安乐死。前肢的直接的方法胸部肌肉和锯肌肌肉筋膜之间的脉管系统采用(图1一个)。Thoraco-dorsal和腋血管解剖和孤立横断后周围神经。腋窝的解剖血管然后继续直到肘关节,inter-osseous动脉孔是地标横断后肱桡肌肌肉骨膜和接触(图1 b)。保留了骨间的船的起源,椎弓根的解剖到腕关节,然后结扎。移植是收获的近端和远端关节脱落后,包括半径和尺骨,连同周围的软组织袖口。一个16克鲁尔接口针插入动脉(图1 c)。此后,移植与肝素化盐水冲洗,而动脉泄漏使用9.0 Dafilon缝合线缝合(布劳恩,西南)。最后,移植被连接到一个Masterflex L / S蠕动泵(Cole-Palmer,弗农山,美国)和灌注12毫升/分钟1 L冷生理盐水血清含有50 UI /毫升的肝素(b·布劳恩医疗SA、比利时)和10µM腺苷(Sigma-Aldrich - 4036)。

图1

图1。血管前翼骨移植物收获和灌注去细胞过程。(A, B):左肱动脉椎弓根的解剖(P *)之间的胸肌,肱三头肌(T),肱二头肌(BB)和上肢肌肉(Bm)与血管蒂的识别(一)。横断面的肢体和前肢肌肉和识别inter-osseous孔及其血管蒂(P *)(B)。为(一)和(B),都是前视图:Ce =头,Ca =尾,P =近端,和D =远端。(C)本机血管前肢肌肉切除后植骨,其保存血管蒂(动脉和静脉,黑色箭头)和尺骨切口(*)。(D)最后脱细胞的前肢植骨后灌注去细胞过程与其保存血管蒂(白色箭头)。(E)轴向截面的脱细胞前肢(C)半径(R)和尺骨(U)。(F)的例子可能分割在灌注脱细胞骨移植物的设置。

2.2 Perfusion-decellularization协议和组织样本

后立即采购、脱细胞骨移植,在室温下,洗涤剂的使用顺序灌注血管蒂根据我们以前公布的协议(Duisit et al ., 2018 b;2018年,一个,2017年),以一个恒定的流量12毫升/分钟:(1)70 L 1%十二烷基硫酸钠(SDS) (27926.295, VWR)紧随其后3 L的磷酸盐(PBS);(2)40 L 1% Triton x - 100 (M143 VWR)随后风潮(250 rpm)一夜之间在一个玻璃罐Triton x - 100年充满1%,紧随其后的是40 L的PBS的动脉灌注。之后,移植在灌注4毫升/分钟和1 L型我从牛胰腺DNAse(11284932001,罗氏,Sigma-Aldrich) 37°C(3),然后用3 L (PBS(4)。移植在4°C存储在PBS。本地和脱细胞移植肌肉中的每个采样,骨膜、骨密质,在近端髓质样本,中央,血管蒂的组织学和远端位置。DNA, ECM蛋白质SDS量化,活检是原生组织和加工是在收获后立刻去细胞后几天内结束。然后他们被冻结在−20°C到使用。

2.3组织学

本机和脱细胞(n = 5)肌肉或骨膜样本固定在4%福尔马林。接下来,他们是嵌入在石蜡,分为5µm-thick切片,染色前安装。相同的协议应用于单元机组或皮质和髓质活检后3周daily-changed浴的脱钙作用除去石灰质的解决方案(甲酸,28%福尔马林,和去离子水)。苏木精伊红()),马森的三色的(MT)和小天狼星红染色进行(SR)。片是数字化和分析使用幻灯片扫描仪(SCN400,徕卡微系统)。4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)进行了染色和可视化使用荧光显微镜(AxioImager Z1,蔡司)。有关免疫组织化学(包含IHC) deparaffinization后,内生氧化物酶被抑制在甲醇3%过氧化氢。非特异性结合位点被封锁5% BSA Tris-buffered Triton 0.05%生理盐水。部分在4°C在一夜之间被孵化anti-GFP (1:5,000 ma5 - 15349, ThermoFischer科学)和anti-osteocalcin (1:10 0, ma1 - 20786, ThermoFischer科学)主要抗体紧随其后peroxidase-conjugated anti-mouse二级抗体(K4001 Dako)或anti-mouse-HRP(715-035-151,杰克逊ImmunoResearch, Bioconnect)。他们发现有3.3′-diaminobenzidine (DAB)过氧化物酶底物(K3468 Dako)。 Nuclei were counterstained with hematoxylin, and slides were mounted with Entellan New (1079610100, Merck, Sigma-Aldrich).

2.4测量DNA和ECM蛋白质

从本地(n = 5)和脱细胞活检(n = 5)骨膜,肌肉,髓质和皮质骨经过冷冻干燥处理。DNA提取,使用DNEasy血液和组织工具包(试剂盒、希尔登,德国),从25毫克湿切片和量化使用quant-it Picogreen dsDNA试剂工具包(L3224 ThermoFischer科学)。笑料和胶原蛋白,使用25 mg和20毫克湿切片,分别是基于Blyscan量化硫酸粘多糖测定工具包(英国Carrickfergus Biocolor有限公司)和总胶原蛋白分析工具包(QuickZyme,生物科学,海牙,荷兰),分别根据每个制造商的协议。意味着DNA量是表示在ng /毫克干重±SD;是胶原蛋白和是笑料μg表达/毫克量干重±SD。

2.5 SDS量化

剩余SDS在肌肉、骨膜和骨基质为每个组织(n = 3)量化使用亚甲蓝活性物质检测(mba)根据以前公布的协议(她名叫et al ., 2014)。简单地说,60毫克进行活检,冻干。标准曲线是为了计算进行SDS数量:1μl SDS 0.5% -0.25% -0.125% -0.0625% -0.0313% -0.01565% -0.0078% -0.0039%和0%(去离子水- DIW)与249μl DIW混合;然后他们被加工样品。矩阵是干重和孵化一夜之间解决方案的蛋白酶K(1.07393.0010,默克,Sigma-Aldrich)(10μl蛋白酶K - 19.1 mg / ml - 30毫米三羟甲基氨基甲烷、液pH值8.0)在50°C。然后,250μl样品或标准和250μl亚甲蓝和漩涡。然后500μl氯仿(1.02445,VWR)被添加到每个样品或标准和漩涡。最后,200μl氯仿层被放置在一个96孔板;这是使用标仪测量651海里(Spectramax I3)。剩余SDS在ECM是根据标准曲线计算,并表示在μg /毫克干重为SDS±SD残留在ECM和μg /毫升±SD消化蛋白酶K SDS浓度的解决方案。

2.6血管评估

评估血管树保存如果半径或尺骨独立可以收获,本地和脱细胞移植动脉注射后本机移植的收获,并对脱细胞移植的去细胞处理后,使用乳胶与硫酸钡混合溶液(243353年,Sigma-Aldrich)和红色染料。他们在4°C中停留一夜,然后成像(n = 3)锥束ct (CBCT) (Planmeca电子产品品牌3 d中,赫尔辛基,FI)。分析了DICOM图像和3 d-reconstructed使用Osirix软件(Pixmeo Bernex, SW)。

2.7骨矿物质密度测量和pQCT收购

骨矿物质密度(BMD);毫克的羟磷灰石/厘米³)的尺骨和半径是评估使用外围定量ct (pQCT, XCT 540 Stratec SA +,诺兰庄园Stratec,德国)前3天内(本地,n = 3)去细胞和去细胞后5天内结束(n = 3)。在每一个骨头,30片间距为0.1毫米,和10在远端进行弹道导弹防御措施,中央,近端血管蒂的位置。30片的值平均为每个骨头,之前和之后的去细胞。数据被表示为平均BMD±标准差。

2.8机械测试

多个同样形状的皮质骨棒从本地和脱细胞骨(为每个:n = 3尺骨;n = 3半径),保存在PBS在4°C,和测试后5天内收获(本机样本)或去细胞(脱细胞样本)。3分折弯测试(图6)进行了2毫米的速度最小⁻¹英斯特朗。直到断裂,使用一个自动^®英斯特朗。英斯特朗5967年,测试机^®伊利诺斯工具有限公司,部门,加冕,韦康比高,雄鹿HP12 3 sy),结果比较。测试被认为是成功的,如果发生了骨折(图6)。曲线进行绘制作用力时(牛顿,N)与垂直位移(毫米)和结果表示为均值±SD骨折发生在N /毫米。此外,四个皮质骨样本(n = 3人,n = 3脱细胞),收获半径和尺骨在每个位置(中心、远端和近端)保存在PBS在4°C,和测试,再次也收获后5天内(本机样本)或去细胞(脱细胞样本),使用硬度测试(图6 d)自动费舍尔机(Microdurometre Fischerscope HM 2000年,费舍尔技术Inc.750马歇尔菲尔普斯Rd。CT 06095温莎,美国)。总的来说,10进行硬度测量皮质样本(图6 d)使用2000 mN负荷,增加和减少20多岁的时候,和5 s高峰时间。结果表示为(高压)的维氏硬度值均值±SD单位。

2.9灭菌和cyto-compatibility测定脱细胞骨基质

骨膜或骨头ECM的7毫米×7毫米被消毒的浴风潮在0.1%过乙酸(PAA)和4%乙醇溶液在一夜之间为骨膜和骨盘6天,每天解决方案更新。随后几个DIW浴和PBS补充1%的抗生素包括青霉素和链霉素(P / S, 15140122, ThermoFischer科学),10μg /毫升(G1397 Sigma-Aldrich)、庆大霉素和2.5μg /毫升两性霉素B(15290 - 026年,ThermoFischer科学)。一夜之间,ECM补丁放在48-well盘子被孵化与杜尔贝科修改鹰介质(Lonza DMEM, 733 - 1698年,Westburg,荷兰);他们补充10%的胎牛血清(的边后卫,10270 - 106,ThermoFischer科学)和抗生素。中删除后,75.000 NIH3-T3细胞(93061524,Sigma-Aldrich) 10µl被播种在ECM光盘或控制井;他们在细胞培养2 h文化孵化器(37°C;5%的公司₂)之前添加1毫升的媒介,是改变每2天。PrestoBlue细胞生存能力分析(A13262 ThermoFischer科学)是为了评估细胞增殖在天1,3,5,7,和16个六播种periostea (n = 3捐助者)。培养基被删除,取而代之的是0.1% PrestoBlue解决方案然后孵化1 h。然后,100μl上层清液被转移到一个96孔板。荧光信号测量使用微型板块荧光计(Spectramax I3^®在560/590 nm),结果表达的荧光强度±SD。)和生活/死染色(l - 3224,生活技术,ThermoFischer科学)进行3天,7和16 (n = 3),以评估的可行的细胞去籽骨和骨膜ECM。可行性百分比(%)在第七天播种骨膜和控制井被量化评估绿色区域(活细胞)之间的比例和加法的绿色和红色(死细胞)地区,把文物后,用百分比表示。后者是量化在四个不同的照片使用荧光显微镜放大2.5倍(AxioImager Z1,蔡司),分析了使用斐济^®软件。

2.10 pAMSC细胞播种文化和骨突ECM分化

猪GFP-pAMSC实验手术提供了优雅和移植实验室(Gianello教授CHEX UCLouvain,布鲁塞尔,比利时)。分离、培养细胞以前公布的(舒伯特et al ., 2011)。大约5×10⁵细胞被播种在每个脱细胞骨基质在两种条件下(n = 3为每个)包括:1)骨ECM +扩散介质(点= DMEM包含2毫米l谷氨酰胺和补充1% P / S和2.5μg /毫升的两性霉素b 1毫升/毫升);2)骨ECM +分化培养基(DM =点+ 1毫米地塞米松(D4902 Sigma-Aldrich), 50 ng / ml的抗坏血酸钠(A4034 VWR)和36毫克/毫升的磷酸二氢钠一水(1.06346,Sigma-Aldrich))。控制,pAMSC被播种在6-well板和培养点或DM。文化板块被安置在一个细胞文化孵化器2 h,以下哪点是添加在每个。经过2天的文化,组1点发生了变化,分化培养基添加到组2。培养基是改变每2天直到osteo-differentiation可见和可评估。文化板块每天观察成骨分化期间使用光学显微镜。22天的文化后,样本formalin-fixed腊标准组织学,以及anti-osteocalcin anti-GFP包含IHC染色。茜素红染色是在第七天控制评估与DM分化;在22天,同样进行两组为了评估pAMSC成骨分化。

2.11统计分析

所有统计分析使用GraphPad棱镜Version 8 (GraphPad软件,圣地亚哥,美国)。所有数据都表示为平均值±标准偏差(SD)。正常使用Shapiro-Wilk测试验证,具体未配对t应用。对于所有的测试,是在统计意义p< 0.05。

3的结果

3.1血管移植骨收获和去细胞过程

总的来说,22前臂骨骼被成功收获来自11个猪,细致的解剖后的血管蒂,在充分保护其内在脉管系统(图1 a - c)。宏观上,从一开始的动脉肝素化血浆灌流,我们观察到一个黑暗的静脉回流,逐渐变得清晰。在SDS灌注,逐步肌肉和骨膜的美白是注意到没有任何变更他们的超微结构。在去细胞灌注结束,所有的具体组织血管化骨移植出现统一的白色,与本国3 d形态完全保存(图1汉英)和血管可以分割的非细胞diaphysal植骨(图1 f)。

3.2去细胞的效率

他走时,DAPI染色显示,皮质骨细胞间隙,骨膜,肌肉,在脱细胞移植和髓质样本(图2 a - k)。我们也注意到完全删除的成骨细胞和破骨细胞骨附着表面和豪希普氏吸收腔,分别。然而,在一些组织部分,我们发现,皮质或松质骨的骨细胞的缺陷区域,存在残余细胞碎片和细胞核出现点状的,比在本地缺损(小图2 f)。一些细胞碎片也可见到髓质。DNA定量证实了这些发现,露出一个主要和DNA含量显著降低,平均降低95%脱细胞组织相比,本地组织。表达的DNA数量,ng /毫克干重±SD (n = 5)脱细胞中发现的肌肉,骨膜,髓质和皮质骨为19.79±19.83,26.71±28.26,1.28±4.43,5.78±11.99,分别与1020 .62±528,977.7±587.9,173.6±163.7,158.7±71.29本地样本,这是50临界水平以下的ng /毫克干重(Crapo et al ., 2011)(图2)。

图2

图2。去细胞效率的评价。(g):他走时组织学染色的本地(上)和脱细胞骨密质(底部)(一),骨膜(B)、肌肉(C)和髓质(D)。放大的本地(顶部)和脱细胞(底部)骨吸收陷窝(豪希普氏缺损)(E),骨细胞缺损(F)和骨附着表面(G);头的箭=豪希普氏腔隙,白色箭头=造骨细胞,黑箭=本机骨细胞,虚线箭头=剩余细胞。规模的酒吧(一)= 100μm,(罪犯)= 200µm和(eg)= 50µm。(H-K):DAPI染色的本地(顶部)和脱细胞骨密质(底部)(G),骨膜(H)、肌肉(我)和髓质(J)。所有酒吧= 100µm规模。(左):DNA量化在本地(N -红色)和脱细胞(D -,蓝色)肌肉(M),皮质骨(B),骨膜(P),髓质(Md) (N = 5,平均值表示ng /毫克干重±SD;* * *p< 0.001,* * * *p< 0.0001)。

3.3细胞外基质保存

)、MT和SR染色证实ECM的保存和组织微观结构以及胶原纤维染色SR的皮质骨(CB)骨膜(P),肌肉(M)和髓质(Md)样品的脱细胞移植(图3 a -)。胶原蛋白分析显示与本地(Nat)和脱细胞的区别(Decell。) (Decell样品。vs Nat: M: 328.8±213.3 vs 417.1±454.1;P: 413.784±185.2 vs 468.0±194.0;Md: 53.2±43.98 vs 151.2±191.6, CB: 136.7±88.21 vs 205.1±41.95μg /毫克干重±SD, n = 5) (图3我)。这些定量数据证实了SR和染色的发现。两种方法揭示了ECM的保护建筑,特别是胶原纤维和组织的胶原蛋白含量,没有明显的组织学和组织的体系结构的修改。此外,插科打诨测量显示骨皮质和髓质(Decell非重大的变化。对Nat: CB: 1.6±0.2 vs 1.0±0.52;Md: 0.3543±0.1 vs 0.8±0.4μg /毫克干重±SD, n = 5),除了肌肉和骨膜,显示本地和脱细胞样本(Decell之间的显著下降。vs Nat: M: 0.4073±0.39 vs 2.890±1.16;P: 0.76±0.81 vs 7.164±2.37μg /毫克干重±SD, n = 5) (图3 j)。

图3

图3。保护ECM和残余SDS量化。模拟:马森的三色的组织学染色本地(上)和脱细胞骨密质(底部)(一),骨膜(B)、肌肉(C),和髓质(D)。规模的酒吧(一)= 100µmµm B-C-D = 200。(情况):小天狼星红染色组织学显示胶原纤维,保护本地(上)和脱细胞骨密质(底部)(E),骨膜(F)、肌肉(G),和髓质(H)。所有规模100µm酒吧。(i j):胶原蛋白(我)和笑话(J)量化在本地(N -红色)和脱细胞(D -,蓝色)肌肉(M),皮质骨(B),骨膜(P),髓质(Md) (N = 5,平均值表达µg /毫克干重±SD;ns=不,* * * *p< 0.0001)。(K-L):SDS残留物为非细胞基质(K)和SDS浓度与1毫升的蛋白酶K消化组织的解决方案(左)在脱细胞皮质骨(B),髓质(Md),骨膜(P)和肌肉(M)相比,0.5% SDS * (0.5% SDS稀释250×)和理论0.5% SDS溶液(n = 3,平均值表达µg /毫升(K)和µg /毫克(左)干重±标准差;* * * *p< 0.0001)。

3.4 SDS残留在ECM量化

SDS是强大的细胞毒性去细胞洗涤剂。mba是用来检测残余SDS与ECM发行后消化后干ECM的蛋白酶K的解决方案。ECM的SDS量低,被其他调查人员(结果比较发现她名叫et al ., 2014)。剩余SDS在组织样本(µg /毫克干重±SD, n = 3)记录如下:M: 0.86±0.62;P: 0.25±0.21;Md: 0.73±0.66;B: 0.081±0.05,整个移植的平均余额是0.48±0.56 (图3 k)。SDS浓度(µg / mL±SD, n = 3)消化解决方案中所有组织灌注明显低于SDS溶液中,对应于M: 13.44±11.67;P: 4.13±4.40;Md: 5.92±1.27;B: 2.25±0.83,而整个移植SDS保留6.52±8.09 (图3 l)。在此基础上观察,SDS-based脱细胞矩阵可以有效清洗DIW和PBS。

3.5血管解剖研究

CBCT收购脱细胞骨移植动脉内的对比注射后(n = 3)证实了血管网络的保护带来的主要骨间动脉发出许多intraosseous船只和骨膜影响时,匹配与本机血管树(图4模拟)。后者两前肢注射移植研究,认真分析。观测表明,整个脉管系统宏观上保存去细胞后,到骨膜和骨内膜的血管网络。此外,实验证实,普通椎弓根可以个性化为了创建径向或尺骨移植(图4 e, F)。

图4

图4。形成血管的血管化骨移植。(f):三维重建的前肢贪污(一)和去细胞后(B)显示血管树保存(R =半径,U =尺骨,p=椎弓根)。CBCT硫酸钡的横向部分注入前翼骨移植物(C)灌注后去细胞(D)(半径R = U =尺骨)显示硫酸钡成endomedular血管的灌注(➤),骨间的血管(白色圆圈),和骨膜下的船只(➢)之前和之后去细胞。保留骨膜血管网络的识别(白色箭头)(E)和intra-osseous穿孔器(白色箭头)(F)解剖后latex-injected脱细胞骨移植物(R =半径,U =尺骨)。

3.6骨矿物质密度测量

意味着BMD的骨骼移植去细胞后显示无显著差异(Nat vs Decell。509.8±182.5 vs 458.5±132.5毫克的羟磷灰石/厘米³,p= 0.435,n = 3) (图5一个)。关于平均半径(R)和尺骨BMD值(U),前后观察去细胞无显著差异。事实上,意味着本机BMD半径为648.2±158.2毫克羟磷灰石/厘米³,557.2±111.4毫克羟磷灰石/厘米³在去细胞(p= 0.75;n = 3)。关于尺骨,BMD的平均值为371.4±27.62毫克羟磷灰石/厘米³和359.8±47.91毫克羟磷灰石/厘米³分别在本机和脱细胞组织(p= 0.8148,n = 3) (图5 b)。

图5

图5。pQCT血管骨移植。(a - b):骨密度(BMD)的平均值(本地、红色)之前和之后去细胞(蓝色)的血管骨移植(平均每个尺骨和径向的BMD值)(一)。特定的径向平均值(R)和尺骨(U)弹道导弹防御(本地、红色)之前和之后去细胞(蓝色)(平均半径的三个平均值或尺骨BMD)(B)。BMD值表示在毫克的羟磷灰石/厘米³不同移植±SD (n = 3;ns=不显著)。

3.7机械测试

3分弯曲试验表明,有一个倾向为径向脱细胞骨干刚度降低,随着全球刚度增加脱细胞尺骨骨干。骨折发生在102.3±50.1 n / 3.3±1.9毫米和76.2±41.5 n /本地6.1±3.6毫米与脱细胞径向棒(图6 b),骨折发生在39 n / 137.4±5.4±1.1毫米和193.6±113.8 n /本地4.5±1.6毫米与脱细胞尺骨棒(图6 c)。然而,考虑到一些测试执行时,没有进行统计分析的3分折弯测试径向和尺骨本机和脱细胞样本,在相同的位置,收获也就是说,中央,近端和远端。(图6 c)。全球和显著增加硬度值(高压)之后去细胞径向和尺骨样本(n = 3本地;3脱细胞),这是更重要的半径样本,也就是说,4.04 vs 10.33维克氏单位本机与脱细胞径向样本(p< 0.0001)(图6 e)和3.18 vs 5.94维克氏单位本机与脱细胞尺骨样本(p< 0.0001)(图6 f)。

图6

图6。机械测试骨基质。(两者):弯曲试验进行径向和尺骨轴。可视化的骨折(一)成功后杆弯曲试验。半径(B)和尺骨(C)3分弯曲曲线(红色=本机,蓝色=脱细胞)实现绘制在图(N)的力与垂直位移(mm)。(D-F)硬度试验在径向和尺骨骨段。可视化的提示打印安装示例(D)。半径(E)和尺骨(F)硬度措施本地(红色)和脱细胞骨基质(蓝色),在维克氏硬度值(高压)表示单位±SD (n = 3每个;* * * *p< 0.0001)

3.8 Cytocompatibility试验:成纤维细胞的细胞播种和文化

生活/死染色(图7 a - c)和圆)(图7 d-f)染色显示附着和可行的细胞表面的骨膜和骨ECM光盘在3天,7和16的文化,活细胞数高于死细胞。此外,他走时染色显示,形成一个连续的ECM光盘表面的细胞层,与特定的成纤维细胞形态。然而,细胞表现出更好的附着力和凝聚力沿骨膜ECM碎片比骨基质。细胞生存能力(%±SD)量化的生活/死染色播种骨膜经过7天的文化并没有发现区别ECM和控制井,生存能力为95.79±2.41%和98.03±0.35%,分别为(p= 0.5512)(图7 g)。增殖率是评估使用PrestoBlue测定,显示荧光强度的增加(±SD) 1天16播种ECM (8.18×10⁷±1.92×10⁷4.42×10⁸±2.83×10⁸,p= 0.0239)和控制井(3.08×10⁸±3.52×10⁷1.04×10⁹±1.04×10⁹,p= 0.0286),相应增加了5.39倍和3.44倍,分别与第一天(图7 h)。这些发现证实了non-cytotoxicity和cytocompatibility ECM生产。

图7

图7。Cytocompatibility研究骨膜和骨基质成纤维细胞的细胞系。(两者):生活/死染色的NIH3T3播种骨膜ECM(上)和骨基质(底部)光盘后3(一)7(B)和16(C)天的文化,分别在2.5倍放大。所有酒吧= 1000µm规模。(d e):圆)染色NIH-3T3播种骨膜ECM(上)和骨后ECM(底部)3(D)7(E)和16(F)天的文化,分别揭示附着纤维母细胞(黑色箭头)40 x放大。所有酒吧= 50µm规模。(G)细胞生存能力分析四种不同的生活/死图片放大总值2.5×播种骨膜和文化控制井后7天(每组n = 3;p= 0.7987,ns=非重要)。(H)细胞增殖率分析使用Prestoblue试验在16天的文化(n = 3×2 ECM;ns=非重要)。

3.9 pAMSC细胞播种文化和骨突ECM分化

控制文化井证实成骨分化与DM pAMSC经过7天的文化,反映在形成钙结节茜素红染色(图8),缺乏成骨分化当pAMSC培养与点(图8 b)。在pAMSC组织培养的22天与骨ECM和DM或点,我们同样观察到钙结节的形成,从而证实骨的成骨潜能ECM被保存(图8 c, D)。钙结节的强度和密度在ECM + DM更重要与ECM +点组。这进一步证实了一个积极的骨钙素染色法检测两组的pAMCS培养骨ECM PM和DM,这是并行执行的GFP染色(图8 eg)。

图8

图8。脱细胞的Recellularization bone-ECM pAMSC和成骨分化。(模拟):茜素红染色法进行直接控制文化井播种与DM与pAMSC经过7天的文化(一)或点(B),以及文化井pAMSC播种与DM骨ECM培养(C)或点(D)文化22天后显示钙化的形成micro-nodules(*)在所有条件除了种子细胞培养点。所有酒吧= 200μm规模。(eg)分别包含IHC染色的GFP(E),骨钙素(F),和消极的控制(G)骨的播种pAMSC ECM培养与DM(左)或点(右)在22天的文化。黑色的箭头显示积极的骨钙素染色GFP-pAMSC对应(所有酒吧= 100µm)规模。

4讨论

据我们所知,这是第一次研究证明实现异体脱细胞骨轴的可行性,同时保留其血管蒂和内在血管,窝藏后续的潜力在活的有机体内移植。此外,这种移植可能是能够支持新骨形成,播种后与接受者的间充质干细胞,进行一个ECM medium-induced成骨分化。这种原始的策略可能是一个新的路径视图获得升级的生物修复骨缺损的替代品。在我们最初的模型设计,我们选择收获整个猪前臂包括半径和尺骨,而不是只有一个,旨在确保最优保存的脉管系统以最小的解剖。然而,在这项研究中,我们演示了选择有个性的半径或尺骨上常见的骨间的椎弓根,这将促进一个轴的移植到一个特定的临界骨缺损。此外,基于这个模型中,我们演示了整个骨移植物的去细胞,包括所有不同本构组织。这PDR协议适应基于先前发表的研究,关注的是动物和人类的面部或解剖亚基组织工程(Duisit et al ., 2018 b;2018年,一个,2017年;伍斯里奇et al ., 2020灌注),显著增加卷。基于自然高密度的皮质骨与软组织主要脸或手移植(肌肉和脂肪),我们假设所需溶剂的体积会更高。然而,去细胞和ECM保护、优化的去细胞的解决方案,流量,压力,和需要的数量仍然必须在未来进一步探讨更有效。我们的研究结果表明,DNA的所有本构组织的血管脱细胞骨移植物低于临界阈值每毫克干重50 ng的DNA,这被认为是脱细胞移植后和安全(Crapo et al ., 2011)。此外,全球细胞数量和DNA含量从我们的分析检索本地皮质骨和本地髓质相比非常低与骨膜和肌肉。每个组织之间的相关显著,证明减少本地和脱细胞样本,确认我们的协议的效率,甚至在组织DNA含量较低。然而,一些残余细胞核或细胞碎片被观察到骨细胞的缺陷,与SDS之前报道,SLES和胰蛋白酶/ EDTA协议(Emami et al ., 2021)。这些残留物可以至少有部分原因是一个不完整的冲刷细胞碎片的骨缺损,通过很窄,因此流量骨细胞骨基质的微管的网络。此外,这也可以解释解剖观察潜在的异质性前肢血管网络,提供的常见的骨间动脉主要产生musculo-periosteal血管化提供的几个小射孔通过其骨膜动脉进入皮质骨表面(赖特和Glowczewskie, 1998年)。因此,一个孤立的长骨模型有一个更大的和主要营养动脉,穿透整个骨髓腔和传播更均匀的轴endocortical表面应该改进的灌注,一个潜在的更好的去细胞和洗涤效果。因此,它似乎是一个更好的模型来研究骨血管再生成一个整体的非细胞移植骨。此外,目前我们团队的初步工作强调了更高效率的细胞清除和清洗通过骨细胞的血管整体的非细胞长骨缺损使用non-detergent去细胞的协议而不是古典SDS协议(分离等。数据没有显示,在提交)。不过,创意的方法依赖于整个内在移植血管的防止损伤的收获,这需要最优保存的骨膜和肌肉骨周围的袖口,通过类比与骨的临床实践自由皮瓣收获(Pederson Grome, 2019;Bibbo 2021)。的确,在解剖血管网络的改变去细胞可能是有害的。

此外,我们的研究提供了令人满意的结果对ECM架构和ECM组件的保护;这些数据是类似于那些获得通过该协议而使用其他生物工程替代品在文献中报道,特别是关于呕吐减少,我们也在这工作(闪避et al ., 2017,2015年;Duisit et al ., 2018 b;2018年,一个,2017年;Gerli et al ., 2018;伍斯里奇et al ., 2020)。这一点尤其重要,因为ECM蛋白质和笑料已报告在文献中是一个关键的细胞支持并进一步recellularization (Crapo et al ., 2011;Peloso et al ., 2016)。关于生物力学性质和密度收购,我们获得了不和谐的结果。由于缺乏更多的样品让我们解释我们的结果在统计上正确的过程(包括与两参数威布尔分布分析),这些问题将在进一步研究作品来自我们部门(邦尼et al ., 2011;setter和Jasiuk, 2014年;Coutts et al ., 2015;李et al ., 2020)。此外,在我们的群体中,平均年龄是很年轻(8.5个月);因此,种植猪和快速重建骨可能引发偏见样本比较。

多在我们的研究结果支持实现cytocompatibility non-cytotoxicity骨和骨膜ECM,也就是说,无菌ECM碎片通过PAA和乙醇消毒(基恩et al ., 2015;Balestrini et al ., 2016),使他们能够促进细胞生长的静态播种NIH-3T3 pAMSC,尽管长博览会灭菌骨骼而不是骨膜ECM的解决方案。杀菌技术可能改变ECM,它们可能有毒的种子细胞(Crapo et al ., 2011;道et al ., 2021)。因此,必须适应这些技术,使他们不那么咄咄逼人。的确,PAA可以改变细胞生长、机械ECM特点,和ECM架构从脱细胞软组织和器官,尽管其他组没有报告这种改变(Moradi et al ., 2020)。然而,如前所述,杀菌脱细胞骨支架使用PAA或PAA和SC-CO的组合₂(超临界有限公司₂)没有改变ECM的机械和结构特性相比,普遍采用的方法,如γ辐照、电子束辐照和环氧乙烷(太阳et al ., 2020;Amirazad et al ., 2022)。然而,通过开发一个完全血管化骨移植作为一种新的治疗选择,这个过程必须适应一个大血管组织,要么使用(Balestrini et al ., 2016;Duisit et al ., 2018 b;2018年,一个,2017年)的血管蒂实现灭菌整个支架(Balestrini et al ., 2016;伯杰et al ., 2020;刘et al ., 2021;道et al ., 2021;Amirazad et al ., 2022),但在不损害血管树。

所有这些结果证实的真正潜力矩阵对于复杂的骨组织工程。多个活细胞评估沿骨膜和骨表面的非细胞ECM静态播种后样品,反映了一个正在进行的“recellularization”。此外,我们表明,获得的非细胞骨ECM显示推广的能力在体外成骨分化的静态播种脂肪间充质干细胞,连同新骨突组织形成和伴随的骨钙素的表达和积极的茜素红染色。此外,这种新的骨突组织可以发起的添加DM或点孤单。这些观察结果进一步强调几个分化生长因子明显保留在ECM去细胞的过程。这些因素的定性性质和定量保存的确必须进一步探讨使用补充调查,包括细胞因子映射和免疫组织化学分析(Mauney et al ., 2005,2004年;舒伯特et al ., 2011)。然而,在临床的角度来看,超导公司的播种和非细胞的分化骨ECM DM似乎更合适和有效的。

总的来说,我们的研究结果出现有前途,反映出真正的未来潜力在活的有机体内再植术。然而,两个主要缺陷仍然必须强调下一个实验步骤。首先,在血管器官组织工程,它已被广泛证明当前的主要限制在活的有机体内再植术recellularized以及血管矩阵恢复一个完整和功能内皮保护血管床的支架(奥兰多et al ., 2012;侯赛因et al ., 2020)。这个再生内皮必须能够确保正确的生理血细胞和血小板之间的交互,以及凝固,粘附和聚集因素是参与凝血过程(富里和富里,1988),为了恢复长期perfusable non-thrombogenic支架血管床没有水肿的形成,从而为种子细胞提供氧气和养分供应。尽管效率高、几乎完全在体外内皮修复非细胞器官显示生理血管流几天后血管吻合术(Uygun et al ., 2010;任et al ., 2015;侯赛因et al ., 2016;东et al ., 2022),这并没有阻止重要血管血栓形成或水肿形成的发生由于障碍泄漏到再生移植物植入(彼得森et al ., 2010;北野et al ., 2021;东et al ., 2022)。然而,开发了几种有前景的解决方案在器官组织工程达到提高药物。这些选项包括血管细胞的结合,包括内皮、平滑肌,外膜细胞细胞(Leuning et al ., 2019)或使用生化修改剩下的血管树ECM (杰克逊et al ., 2014;侯赛因et al ., 2016;Devalliere et al ., 2018)通过抗血栓或pro-cell移植试剂。

此外,在活的有机体内再植术实验使用大型动物模型,首先通过节段血管脱细胞骨同种异体移植物,然后利用脱细胞骨同种异体移植物,应进行可靠和可复制的临界大小的骨缺损的动物模型。评估质量的骨整合通过客观结果与当前的临床解决方案相比,连同一个长期分析骨移植物的生存能力和osteointegration,出现强制在考虑潜在的翻译为人体临床模型。几个工作目前正在执行整个全球科学界为了创建可靠的和最佳的血管化骨替代品,osteointegration,在活的有机体内细胞成骨分化,最后目标是:大骨缺损的修复。

5的结论

我们提出并证明了在这个研究一项新技术的可行性根据收获完全血管骨移植,然后通过灌注脱细胞以获得一个可移植的移植骨“现成的”。在体外收集细胞培养的结果,从我们的大型动物模型是有前途的,因为他们已经证明了pAMSC成骨分化的启动bone-ECM标准培养基(PM)或特定的成骨培养基(DM)。进一步在体外关键实验仍然需要评估,在recellularization步骤,正确的细胞分布在3 d模式非细胞整体的哈佛氏系统通过血管移植骨播种通过特定的灌注生物反应器。鉴于这种情况,血管播种后的成骨分化可能执行的间充质干细胞在长在体外细胞培养的过程。此外,超导公司的播种,然后他们oesteogenic分化与再生的整个和内皮功能创建一个non-thrombogenic无疑是必要和可行的移植后移植,这是能够接受自然骨重塑所引导的接受者,从而允许对一个稳定和生活osteo-integrated贪污。

数据可用性声明

最初的贡献提出了研究中都包含在本文/辅料,可以针对相应的作者进一步询问。

道德声明

动物研究是由当地伦理委员会审查和批准的UCLouvain(比利时布鲁塞尔)和实施按照比利时(皇家法令,2004年9月)和欧洲立法问题(指令- 2010 - 63)。

作者的贡献

所有作者同意负责的工作内容。研究设计:GR、LM、CB和提单。猪组织收获:GR和再保险。实验操作(组织学,包含IHC、量化和细胞培养):GR, LM,低频,DX, JM,和再保险。血管树分析:GR和罗依。机械测试和分析:GR、JB、FS、NK、和NT。手稿撰写和校对:GR, LM,低频,JM,再保险公司提单,CB,和PG。监督:提单,CB, PG。

资金

作者声明他们已经收到资金,而这是可能由于工作基金会des Gueules混浊格兰特,N 87 - 2019°和防止衰老的“再生医学”项目由Jean Degroof-Marcel Van Massenhove ASBL和ASBL Saint-Luc基金会。

确认

Guillaume鲁吉尔的家伙”基金会des Gueules混浊”。这项工作被一个F.R.S.也支持-FNRS(国家de la任职背景,比利时)的基金颁发博士路易斯Maistriaux(野心家基金:ID 40000380),博士朱莉侬(野心家基金:ID 40004991),和罗宾博士分离(野心家基金:ID 40010491)。我们感激地感谢学校的手术在巴黎“拿来一个冰川锅穴”的显微手术设备的贷款和全球支持本研究。作者另外感谢Jerome博士Duisit提供初步支持这个项目,克里斯汀·德城镇de Goyet帕斯卡尔塞格尔,格温Baurin,武术Vergauwen,米歇尔Cougnon,沃尔特Hudders专门技术援助。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

出版商的注意

本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。

缩写

CB、皮质骨;CBCT锥束ct;DAPI 4′, 6-diamidino-2-phenylindole;DIW,去离子水;DM、分化培养基;ECM,细胞外基质;的边后卫,胎牛血清;笑话,粘多糖;GFP,绿色荧光蛋白;他走时,苏木精和伊红; HV, hardness values; IHC, immunohistochemistry; M, muscle; MBAS, methylene blue active substances assay; Md, medulla; MT, Masson’s trichrome; P, periosteum; pAMSC, porcine GFP-adipose mesenchymal stem cells; PBS, phosphate-buffered saline; PAA, peracetic acid, PDR, perfusion-decellularization recellularization process; PM, proliferation medium; pQCT, peripheral quantitative computed tomography; P/S, penicillin/streptomycin; RPM, rotation per minute; SC-CO2, supercritical CO2; SD, standard deviation; CO2SD, standard deviation; SDS, sodium dodecyl sulfate; SR, sirius red.

引用

Abdollahiyan, P。Oroojalian F。,Mokhtarzadeh, A., and Guardia, M. (2020). Hydrogel-based 3D bioprinting for bone and cartilage tissue engineering.Biotechnol。J。15日,2000095。doi: 10.1002 / biot.202000095

CrossRef全文|谷歌学术搜索

Amirazad, H。,Dadashpour, M., and Zarghami, N. (2022). Application of decellularized bone matrix as a bioscaffold in bone tissue engineering.生物。Eng。16日,1。doi: 10.1186 / s13036 - 021 - 00282 - 5