Co-sensitization之间豆类是常见,但变量并不是临床相关

介绍

可持续替代饮食蛋白需要与当前畜牧业生产和消费的肉类产品对资源,比如水,有一个负面影响农业土地和环境(1,2)。豆类蛋白质的来源可以是一个有吸引力,因为他们富含蛋白质、纤维、维生素和矿物质(3)。使用豆类和(集中)豆类蛋白质分离从豌豆,扁豆、大豆、羽扇豆,鹰嘴豆、豆类作为替代肉类蛋白质增加了由于日益增长的环境问题和健康问题的消费者(4,5)。增加食用豆类和豆类蛋白质(隔离)派生的新颖的食物可能增加这些食物致敏和过敏的患病率。此外,大豆类的蛋白质可能引起过敏投诉已经legume-allergic(例如,花生和大豆)的人口。

敏化作用和过敏到多个豆类legume-allergic患者进行一些先前的研究(6- - - - - -9)。詹森等人报道的高频co-sensitization羽扇豆、大豆、豌豆、紫花苜蓿、绿豆、蚕豆、azuki bean在10花生过敏患者(8)。此外,co-sensitization和co-allergy花生过敏患者的狼已经建立在其他研究(10- - - - - -12)。先前的研究主要集中在co-sensitizations而不是co-allergies。此外,研究主要表现在花生过敏的病人。此外,调查豆类的数量往往是有限的,包括病人的数量很小。此外,研究主要调查了co-sensitization之间(商业、容易可溶性蛋白质)提取不同的豆类和对co-sensitization蛋白质水平的家庭和个人的蛋白质。这些蛋白质家族包含种子贮藏蛋白质如7 s (vicilin-type)和11 s球蛋白(legumin-type)属于因预测家庭和2 s白蛋白属于醇溶谷蛋白家族(13,14)。敏化种子贮藏蛋白质被发现是一个重要的诊断过敏的标志(15)。

它建立了花生、大豆和凶残的过敏是最常见的食物过敏,因此需要强制性的标签(16)。因为其他豆类的消费越来越多,重要的是调查的频率之间co-sensitization和co-allergy这些豆类和评估如果可能造成的风险已经legume-allergic病人。本研究的主要目标是调查的频率co-sensitization和co-allergy 10个不同的豆类(绿色花生、大豆、豌豆、鹰嘴豆、蓝白相间的狼,黑色和绿色扁豆、蚕豆和白色)6 legume-allergic患者组(花生、大豆、豌豆、羽扇豆、扁豆、和bean-allergic病人)。第二个目标是研究蛋白质分数(7 s / 11 s球蛋白,2 s白蛋白,白蛋白)和个人负责co-sensitization蛋白质。

方法

病人的选择

代表随机群30成人门诊病人来访的变态反应学乌得勒支大学医学中心与豆类对花生过敏,大豆、青豌豆、羽扇豆、扁豆或bean被纳入研究。这个数字没有达到时,所有可用的过敏患者。选择诊断患者最好是通过积极的口服食物激发或令人信服的历史结合积极的免疫球蛋白E (IgE)测试血液中(> 0.35 kU / L, ThermoFisher,乌普萨拉,瑞典)。概述的细节包括病人中可以找到补充表S1。

准备和隔离豆科植物提取物、蛋白质分数,和个人的蛋白质

未经加工处理和热提取和蛋白质分数从花生(花生hypogaea),大豆(大豆),青豌豆(Pisum一,鹰嘴豆(中投arietinum),蓝色卢平(Lupineus狭叶的)和白羽扇豆(Lupineus阿不思·),黑扁豆(镜头culinaris)和绿扁豆(镜头culinaris puyensis),蚕豆,蚕豆根尖和白色豆(菜豆)。广泛,如前面描述的(17)。蛋白质分数,7 s / 11 s球蛋白(盐可溶性球蛋白),2 s白蛋白(醇溶醇溶谷蛋白)、白蛋白(水溶性白蛋白)提取使用重金属教父奥斯伯恩萃取过程改编自Freitas et al。(18)。简而言之,球蛋白分数被增溶的脱脂豆类食物收集高盐缓冲(100毫米三羟甲基氨基甲烷/盐酸,液1 M氯化钠,10毫米EDTA和10毫米EGTA, pH值8.2)和离心法。后来的上层清液收集含有溶解在高盐缓冲的球蛋白。通过使用100 kDa超滤,上层清液分为7 s和11 s球蛋白比例(滞留物)和2 s白蛋白(渗透)分数。个人从花生种子贮藏蛋白质(Ara h 1, Ara h 2, Ara h 3, Ara h 6),大豆(g m 5和g m 6),蓝色狼(α-conglutin,δ-conglutin,羽扇一1),青豌豆(豌豆蛋白1,豌豆白蛋白2πs 1和豆球蛋白),和白色的bean(菜豆素和豆球蛋白)准备中描述史密特et al。(17)。7.0201 (Acc重组花生过敏原Ara h。不。B4XID4)是由EUROIMMUN提供。

行污点

蛋白质分离提取、蛋白质分数,和个人被放在EUROLINE地带(EUROIMMUN,吕贝克,德国)由EUROIMMUN专门为这项研究。敏化是根据标准评估制造商的指示。EUROLINE强度单位(EL)进行评估使用EUROLineScan软件和碳水化合物可交叉反应的决定因素(CCD)阳性血清抑制后重新分析了Anti-CCD吸收剂(EUROIMMUN)。3(第1类)或更高的强度被评为积极。

质分析的蛋白质分数

20µg 2 s白蛋白和7 s / 11 s球蛋白分数被稀释至0.5毫克/毫升100毫米三羟甲基氨基甲烷(pH值8.0)液(总共40µl)。8µl SDS 2.5% (w / v最终浓度0.42%)被添加到样品和蛋白质受到削减,烷基化,胰蛋白酶的消化和强阳离子交换StageTip净化如前所述(19)。一夜之间蛋白水解作用是通过增加400 ng胰蛋白酶/ 20µg样本(E: S 1:50的比率)。白蛋白分数都以类似的方式处理,但稀释到0.5毫克/毫升在HPLC-grade水的第一步,而不是100毫米三羟甲基氨基甲烷(pH值8.0)和500毫米三液添加到2.5% SDS的解决方案是添加到样本与德勤之前减少。NanoLC-MS上执行一个简单的LC / MS分析1000纳米液相色谱系统(热费希尔科学)耦合Q-Exactive质谱仪(热科学)与小的变化(如前所述20.)。四个每毫升(100 ng)的蛋白质分数被装载在一个500 nl /分钟流量分析柱,通过反相柱和肽筛选了通过一个45分钟的线性梯度。使用蛋白质组数据处理女士发现者v.1.4(热科学)和SEQUEST搜索引擎。蛋白质被确定通过搜索质量光谱数据与Uniprot豆科数据库(434155项)于2017年9月通过。蛋白质达到基于2成功肽识别(通过过滤器过滤,罗斯福< 0.01)被认为是有效的。

sds - page分析

15µl(1µg /毫升)的提取或蛋白质分数混合5µl 4×Laemmli样品缓冲(BioRad大力神,CA)与德勤补充。样本加热5分钟在95°C和涡之后不久。5µl精度+蛋白质双颜色标准标记(BioRad大力神,CA)和10µl蛋白质样品被加载到任何的井kD™Mini-PROTEAN®TGX™预制蛋白质凝胶(BioRad大力神,CA)在缓冲罐(Bio-Rad实验室Mini-PROTEAN利乐细胞™)满1×TGS (BioRad大力神,CA)。凝胶的染色在一盘瓶与InstantBlue™(Coomassie)凝胶染色(英国Expedion)然后用软化水冲洗至少1 h和图像的凝胶(ChemiDoc™MP)。

抑制试验

花生的族群,青豌豆和lentil-allergic科目选择抑制化验。研究不同的能力2 s白蛋白和7 s / 11 s分数抑制IgE绑定,从选定的患者与未加工的2 s pre-incubated血清白蛋白或7 s / 11 s分数的花生,绿豌豆和扁豆。短暂,1、10、100µg /毫升的各自的分数被添加到1:10 (EUROLINE洗涤缓冲)稀释血清和孵化为30分钟在室温下一个轨道瓶(300 rpm)。随后,一行污点。相同的蛋白质提取,用于准备线印迹和执行抑制试验。Pre-incubation与牛奶提取作为消极的控制。积极的控制由pre-incubation分数相同的IgE (self-inhibition)和病人并没有显示self-inhibition被排除在分析之外。抑制是按照百分比计算的不是抑制测量。

定义

Co-sensitization发生在不同的IgE抗体是由病人与蛋白质结合,但不一定是针对常见的结构特点(21)。相比之下,可交叉反应的IgE绑定的特征是IgE抗体结合结构同源蛋白质,有共同抗原表位,大可以专门由抑制化验(21)。同样,co-allergy被定义为临床过敏投诉的存在两个或两个以上的来源,和cross-allergy被定义为存在临床过敏引发的投诉可交叉反应的IgE绑定到多个来源。

数据分析

描述性分析报告的频率(合作)敏化和(合作)过敏使用SPSS统计25 (IBM公司,阿蒙克,纽约,美国)。此外,优势比(或)计算调整后的霍尔丹修正评估豆类敏化之间的关系和过敏。基本的局部比对搜索工具(BLASTP)是用于调查身份的百分比。匹配的身份表示潜在的大(超过50%22)。

结果

co-sensitization率高10豆类在不同legume-allergic组

敏感的频率为10个不同的豆类(绿色花生、大豆、豌豆、鹰嘴豆、蓝/白羽扇豆,黑/绿扁豆,单/白色豆)在六legume-allergic病人组(花生n= 30,大豆n= 30,绿豌豆n= 30,羽扇豆n= 30,扁豆n= 17和豆n= 9)所示表1。在所有6 legume-allergic患者组,co-sensitization为每个测试豆类的比例至少36.7%。bean-allergic病人组co-sensitization其他豆类的频率最高(77.8%至100%),而在大豆和花生过敏患者团体低利率(36.7% - -76.7%)被发现。的百分比表1表示,当病人对绿豌豆,过敏羽扇豆、扁豆或bean,他们最有可能的致敏其他豆类(从58.8%到-100%)。相比之下,患者对花生过敏或其他豆科植物大豆不太可能致敏(36.7% - -76.7%)。

过敏病人总是敏感其他豆类,而花生、大豆和绿色pea-allergic病人

个别敏感资料的六个legume-allergic患者团体各种豆类蛋白质提取提供了图1。每个单独的显示在的过敏症状图1一个。有限程度的mono-sensitization发现大豆(16.7%)、花生(10%),和绿色pea-allergic(3.3%)患者团体。Co-sensitization所有10豆类经常被看到在所有legume-allergic病人组(花生(23.3%)、大豆(33.3%)、青豌豆(50%)、羽扇豆(43.3%)、小扁豆(41.2%)和bean (66.7%)(补充表S3和图1 b))。值得注意的是,co-sensitization不到六豆类没有看到狼,扁豆,和bean-allergic病人与花生、大豆和绿色pea-allergic病人组。这表明羽扇豆、扁豆和bean-allergic患者总是敏感其他豆类,而花生和soybean-allergic患者。相当比例(20%)的soybean-allergic病人没有IgE绑定到一个测试大豆提取物。这是最有可能由于缺乏PR10-protein g m 4,豆浆、重要的过敏原提取物(补充表S3)。

Co-sensitization主要归因于7 s / 11 s球蛋白,而不是(2 s)白蛋白

IgE绑定不同的蛋白质分数被热量地图进一步评估图1 c(7 s / 11 s球蛋白),图1 d(2 s白蛋白),图1 e(清蛋白)。高频率之间的co-sensitization 7 s / 11 s球蛋白观察10豆类的分数,强度IgE绑定配置文件类似于敏感概要文件所示图1 b(任何提取、部分或组件)。的平均强度IgE绑定为每个测试豆类一直高7 s / 11 s球蛋白分数2 s白蛋白,白蛋白分数相比,除了花生2 s白蛋白分数。Co-sensitization 2 s白蛋白分数之间更频繁地看到白蛋白相比分数。最著名的co-sensitization被2 s白蛋白分数的花生和绿色小扁豆。花生过敏患者的66.7%,花生致敏2 s白蛋白分数,也致敏2 s白蛋白的绿色小扁豆。lentil-allergic亦然,41.2%的病人也2 s白蛋白分数从花生过敏。白蛋白的敏感频率分数普遍低,除了花生。

高频率的co-sensitization个人7 s和11 s球蛋白之间不同的豆类

个人之间的频率co-sensitization 7 s球蛋白(图2一个),11 s球蛋白(图2 b),2 s白蛋白(图2 c)进一步探讨个人豆类蛋白质。Co-sensitization个人7 s和11 s球蛋白是大豆中高度流行,绿豌豆,羽扇豆、扁豆、bean-allergic病人群体,符合高Co-sensitization 7 s / 11 s球蛋白分数之间的各种豆类。有趣的是,7 s和11 s球蛋白co-sensitization是一般常见,除了菜豆素和豆球蛋白白色豆。为这些蛋白质很低的频率敏感,即使在bean-allergic病人组。Co-sensitization花生2 s白蛋白和之间δ-conglutin从蓝狼比花生和豌豆白蛋白之间更频繁地见过1,尤其是在lupine-allergic病人组。Co-sensitization之间的豌豆白蛋白2,花生过敏原,和蓝色的卢平δ-conglutin被观察到。5个中的7绿色pea-allergic患者致敏豌豆蛋白1是mono-sensitized 2 s白蛋白。在一起,数据表明co-sensitization之间主要是看到7 s和11 s球蛋白和2 s白蛋白之间的程度较轻。

Co-sensitizations通常不是临床相关

花生和soybean-allergic病人,co-allergies绿豌豆,羽扇豆,扁豆和bean罕见(≤16日7%),而在青豌豆,羽扇豆,扁豆,bean-allergic病人花生(64.7% - -77.8%)或大豆(50% - -64.7%)co-allergy常见(图3,表2)。的co-allergy bean(0% - -35.3%)是最常见的co-allergy组。相反,co-allergies大多数其他豆类经常bean-allergic组(55.6% - -77.8%)。此外,有趣的是,在soybean-allergic病人花生的频率(63.3%)co-allergy co-allergy其他豆类相比是更高(3.3% - -16.7%)。legume-allergic组,co-allergy的频率普遍而co-sensitization的频率。这表明相当一部分观察co-sensitizations可能不是临床相关。不同蛋白的致敏的临床相关性分数(图3汉英)是复杂的解释。因此,我们计算了或临床相关食物过敏敏化7 s / 11 s球蛋白或2 s白蛋白分数。(表2)。敏感的7 s / 11 s球蛋白或从花生2 s白蛋白分数显著增加的风险在大豆、花生co-allergy绿豌豆,羽扇豆,lentil-allergic不敏感的病人相比,病人7 s / 11 s球蛋白或2 s白蛋白分数从花生(或从12.89 (95% CI 1.97 - -84.12), 94.71 (95% CI 4.39 - -2041.8))。花生和soybean-allergic患者致敏从狼2 s白蛋白分数,有更高的机会有一个狼co-allergy相比,病人不敏感2 s白蛋白分数从狼(-88.95或11.18,95% CI 1.41对花生和大豆)。然而,大多数的或未达到统计上的显著水平,表明co-sensitization往往不是与临床相关的co-allergy有关。总之,co-sensitization 7 s / 11 s球蛋白或2 s白蛋白分数从花生与临床相关的co-allergy花生在几乎所有legume-allergic病人组,而co-sensitization 7 s / 11 s或2 s白蛋白分数与其他豆类在临床上不相关。

大之间发生小扁豆和绿色豌豆但不是扁豆和花生

抑制进行了化验为例调查是否(程度)临床相关和不相关co-sensitization是由大族群的花生、青豌豆和lentil-allergic科目(补充表S2,补充图S1)。之间潜在大花生,扁豆分数(2 s白蛋白和7 s / 11 s)被cross-inhibition IgE绑定使用血清检查从花生过敏和lentil-allergic科目(图4一,补充图S2)。抑制剂浓度的10µg /毫升用作负控制100µg /毫升显示抑制血清3(黑色十字架)。Pre-incubation花生2或7 s / 11 s分数导致了一些抑制IgE绑定到相应的扁豆分数(抑制2 s白蛋白中位数:11%,平均抑制7 s / 11 s球蛋白:67%)。亦然,没有抑制或只有有限的抑制的IgE绑定2 s白蛋白和7 s / 11 s花生分数与各自观察到在pre-incubation扁豆分数。这些观察表明,花生分数是敏感,在有限的范围内,负责co-sensitization扁豆分数。然而,扁豆和花生之间co-sensitization不是造成的主要致敏扁豆分数。与花生过敏,pre-incubation扁豆和青豌豆2 s白蛋白或7 s / 11 s分数导致了抑制(79%到90%)的IgE绑定在扁豆和pea-allergic科目(图4 b)。因此,临床相关的绿色豌豆和扁豆之间co-sensitization受试者co-allergic绿色豌豆和扁豆在很大程度上可以解释为大。

讨论

这项研究显示,co-sensitization豆类在不同legume-allergic患者组之间非常普遍。羽扇豆、扁豆,豌豆和bean-allergic患者致敏多个其他豆类、花生和soybean-allergic患者相比,通常是低致敏(er)其他豆类。7 s球蛋白和11 s球蛋白种子贮藏蛋白质有可能观察co-sensitization的主要贡献者。高co-sensitization率与只有相对较少的患者的临床症状(例如,16.7%的花生过敏患者co-allergic狼虽然70%的花生过敏患者被狼)致敏。值得注意的是,co-allergy花生和soybean-allergic患者罕见,而co-allergy绿色豌豆,羽扇豆,扁豆,bean-allergic病人发生频繁。但应该指出的是,蒙蔽口服食物挑战对过敏源的研究应该进行确认或排除的存在(合作)过敏反应。这些数据强调知识大及临床相关性评估安全是很重要的对食物过敏患者介绍(小说)的食物。

相当比例(> 23.3%)的legume-allergic患者致敏所有10个测试豆类和mono-sensitization只看到在花生、大豆和绿色pea-allergic集团在一定程度上(3.3% - -16.7%)。大量有趣的是,co-sensitization(≥6)豆类发生频率较低的花生和soybean-allergic病人组与绿豌豆,羽扇豆、扁豆,bean-allergic病人组。以前的研究也发现,敏感多豆类是频繁的,但大多数这些研究只调查co-sensitization花生过敏患者(6- - - - - -9,23)。巴奈特等人报道,38%的花生过敏患者IgE豆类在他们的研究中对所有测试(花生、豌豆、大豆、扁豆和棕色扁豆提取)(9)。相比,巴奈特和他的同事们的研究,我们发现,66.7%的花生过敏患者致敏5或更多的豆类。然而,比较研究是困难的,相同的豆类没有评估。

7 s / 11 s球蛋白分数是观察到的主要贡献者co-sensitization不同豆类。这是由于IgE绑定强度高出一般7 s / 11 s分数相比,2 s白蛋白,白蛋白分数。必须指出残留的蛋白质可能留在分数无意中,经质和sds - page分析(方法的细节可在网络存储库和结果中可以找到补充表S4,补充图S3,补充图S4)。这些残留物可能影响IgE绑定到不同的分数。然而,大多数蛋白质主要在预期的分数(例如,Ara h 2 2 s白蛋白分数)。此外,IgE-binding个人2 s,结果7 s和11 s蛋白的蛋白质分数与加强了我们的结果。

Co-sensitization个人7 s球蛋白和11 s球蛋白之间不同的豆类是经常看到的,这也解释了的实质性作用7 s球蛋白和11 s球蛋白在Co-sensitization豆类。co-sensitization率高是最有可能归因于高百分比的氨基酸序列标识(34.2 -62.6%)(补充表S5)。身份的比例较高(> 50%)被报道表明潜在的大(24)。有趣的是,co-sensitization 7 s / 11 s球蛋白比例与其他豆类被从白色豆,虽然co-sensitization低个人7 s和11 s球蛋白的蛋白质从白色bean。造成这种差距的原因目前还不清楚,但可能这另一个(不明)7 s / 11 s球蛋白,引起的co-sensitization白色豆7 s / 11 s球蛋白分数和其他7 s / 11 s球蛋白分数。

Co-sensitization 2 s白蛋白之间少7 s / 11 s球蛋白相比,虽然标志着Co-sensitization看到2 s白蛋白之间的分数从花生和扁豆。不幸的是,我们使用单个蛋白质无法证实这一点,因为从扁豆2 s白蛋白(s)尚未确定。Co-sensitization之间从绿豌豆,豌豆蛋白1与其他2 s 2 s白蛋白,白蛋白(Ara h 2 6 7.0201,δ-conglutin)是罕见的,这可以解释之间的低比例的身份豌豆蛋白1和2 s白蛋白(补充表S5)。低比例的身份还发现豌豆白蛋白2,虽然co-sensitization这种蛋白质和其他2 s白蛋白经常被看到。这表明序列的身份只是部分负责观察co-sensitization。目前在我们看来豌豆蛋白1和2不正确地贴上2 s白蛋白比例的身份与其他2 s白蛋白低,有与其他2 s白蛋白结构差异大。值得注意的是,mono-sensitization发现豌豆蛋白1在20%的30绿色pea-allergic病人,指示的潜在价值在诊断豌豆这种蛋白质过敏。我们cross-inhibition实验表明,co-sensitization青豌豆和扁豆之间病人co-allergic绿色豌豆和扁豆在很大程度上可以解释为大。然而,大是有关在一定程度上co-sensitization花生和扁豆分数之间的关系。需要进一步抑制的研究来阐明co-sensitizations的高速率是否在本研究发现不同的豆类是由大引起的。

这项研究显示,大部分的co-sensitizations没有临床相关。尤其是在花生和soybean-allergic病人组,我们注意到,与其他豆类co-allergy罕见。co-allergy的频率可能会略微低估,因为数据在我们的研究没有收集系统标准化的问卷,但是使用可用的数据从患者电子文件从日常护理。然而,我们认为以这种方式收集数据并不是一个可能的解释临床上无关紧要的敏化作用。在绿色豌豆、羽扇豆、扁豆和bean-allergic病人组,co-allergy花生几乎是不可避免的(74.7% - -77.8%)和与其他豆类co-allergy出现频繁(高达82.4%)。临床过敏患者的低频率敏感豆类被其他人之前报道(6,7,23)。例如,一杯啤酒等人显示32花生过敏患者17被大豆致敏和15豌豆,但临床相关的反应被认为对食物只有一个病人(23)。我们的研究表明,IgE绑定只在少数legume-allergic导致临床症状的病人,特别是在花生过敏患者。看来,敏化(过敏)引起的花生、大豆和(在较小程度上,遵循完全不同的模式把co-sensitization和co-allergy相比其他豆类。

总之,我们表明,co-sensitization豆科植物之间在不同legume-allergic患者团体经常见,但是,大比例的这些co-sensitizations不是临床相关。观察到co-sensitization可以主要归因于7 s和11 s球蛋白,尽管2 s白蛋白也可以负部分责任。豆类是一个有吸引力的可持续的蛋白质来源,但可交叉反应的过敏反应在legume-allergic人口不能排除co-sensitization,并在较小程度上,co-allergy多个legume-allergic病人组中观察到。未来的研究,包括更大的病人组需要确认这些发现。

数据可用性声明

原始数据支持了本文的结论将由作者提供,没有过度的预订。

道德声明

本研究进行了按照乌得勒支大学医学中心生物法规,遵守适用的国家和国际法律法规。这项研究是生物研究伦理委员会批准的“乌得勒支大学医学中心(协议号18 - 428)。这些规定允许使用的剩余材料从诊断检测的研究,除非病人对象(第八条,“不反对”过程)。没有包括病人反对使用他们的血清。

作者的贡献

AJ纯化蛋白质用于实验。女士,MG, EA, PV进行实验和MS, PW, EA, PV进行统计分析。女士起草了手稿。女士,KV,正义与发展党、GH和TL导致的概念和设计实验,计划、解释和审查的手稿。所有作者的文章和批准提交的版本。

资金

项目是小说的一部分蛋白食品安全项目(ScenoProt),这是由芬兰科学院的战略研究委员会。

确认

作者要感谢贝蒂娜白利(EUROIMMUN)为她提供线印迹和试剂和关键的讨论结果。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

出版商的注意

本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。

补充材料

本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/falgy.2023.1115022/full补充材料。

引用